人红细胞生成素乳腺特异性表达载体构建及其可行性检验方法的建立

将大鼠乳清酸蛋白（ＷＡＰ）基因的上游调控序列与人红细胞生成素基因组ＤＮＡ融合,构建了ｐＷＡＰ－ＥＰＯ－ＷＡＰ３乳腺特异性表达载体,该载体经脂质体包裹后,通过显微外科技术,经乳腺导管注入妊娠中后期大鼠乳腺中进行表达。经ＥＬＩＳＡ检测,大鼠乳汁中有ＥＰＯ表达,外周血网织红细胞计数法测定表达的ＥＰＯ具有体内生物活性,说明乳腺导管注入法是一种较理想的评价乳腺特异性表达载体可行性方法     

HeLa细胞中Skp2的表达调控p21WAFCIP1稳定性

泛素 蛋白酶体抑制剂MG 132处理的HeLa和SaoS 2细胞中 ,低表达的p2 1WAF CIP1受泛素 蛋白酶体通路调控 .为探讨肿瘤细胞中高表达的E3连接酶底物结合亚基 Skp2和低表达的p2 1WAF CIP1之间的关系 ,在HeLa细胞中转染Skp2的反义寡核苷酸后 ,p2 1表达水平明显升高 .同时 ,相对于转染空载体和Skp2ΔF(Skp2的F box缺失突变体 )的真核表达载体 ,转染全长Skp2的HeLa细胞中 ,p2 1表达水平显著下降 ,说明肿瘤细胞中Skp2调节p2 1的稳定性 ,并且这种调控作用依赖于Skp2蛋白中的F box结构 .免疫荧光结果表明 ,Skp2和p2 1共定位于细胞核 ,这为两者间的相互作用提供了前提 ;体内相互免疫共沉淀结果表明 ,p2 1和其它SCFSkp2 的底物一样与Skp2直接结合 ,并且它们之间的结合区不在F box结构域 ,这一结果在体外的GST pulldown实验中得到验证     

DNA损伤生物学反应中ATM对p21~(WAF1/CIP1)蛋白的直接磷酸化

毛细血管扩张性共济失调症突变蛋白 (mutatedinataxiatelangiectasia ,ATM)是直接感受DNA双链断裂损伤并起始诸多DNA损伤信号反应通路的主开关分子 .已有研究发现 ,DNA损伤生物学反应中 ,ATM可通过磷酸化活化p5 3,继而转录活化细胞周期检查点蛋白p2 1WAF1 CIP1的表达 ,而对于ATM是否直接参与p2 1WAF1 CIP1的早期活化迄今尚无实验证明 .通过免疫共沉淀反应 ,检测到细胞电离辐射 (ionizingradiation ,IR)反应早期ATM与p2 1WAF1 CIP1蛋白存在相互作用 .将p2 1WAF1 CIP1蛋白编码基因全长克隆入原核表达载体pGEX4T 2 ,经诱导表达及亲和层析纯化获取GST p2 1融合蛋白作为磷酸化底物 .体外磷酸化实验检测证明 ,IR活化的ATM具磷酸化p2 1WAF1 CIP1蛋白的功能 ,并且此磷酸化功能可被PI3K家族特异性抑制剂Wortmannin所抑制 .结果揭示了IR后ATM可通过直接磷酸化p2 1WAF1 CIP1蛋白 ,在IR致DNA损伤生物学反应早期调控p2 1WAF1 CIP1蛋白的快速活化过程     

反义RNA抑制存活素基因的表达对HeLa细胞的影响

为研究存活素（survivin)基因在肿瘤细胞中的应用,通过RT-PCR从HeLa细胞中克隆得到存活素cDNA的编码区,将其反向克隆到可诱导型表达载体pHC中,得到存活素反义RNA表达的载体pHSC,通过脂质体的介导,将pHSC导入HeLa细胞中,经C418（800nmol/L)筛选获得可以诱导表达存活素反义RNA的稳定细胞株HeLa-pHSC。获得的细胞株在2mmol/LZn^2 的诱导下,可以表达存活素反义RNA,从而抑制存活素基因的表达,此时HeLa细胞的增殖受到抑制,对化疗药物的敏感性增加,在G2/M期可以减缓细胞周期的进行性,这表明存活素对维持肿瘤细胞的增殖以及细胞周期的进行具有非常重要的作用。     

Skp2参与HeLa细胞G_2/M周期检查点的调控

具癌基因特性的Skp2在大多数肿瘤组织和肿瘤细胞中异常高表达,它作为SCFSkp2复合物的底物识别亚基调控p27KIP蛋白的稳定性而促进细胞G1/S期转换.为进一步明确Skp2与G2/M周期检查点的关系,在HeLa细胞中过表达Skp2以及通过反义寡核苷酸抑制Skp2表达.结果发现:Skp2能促进细胞周期运转,表现为S期细胞增多和G2/M期细胞减少,其中F-box结构域具有重要的功能意义;反义寡核苷酸抑制Skp2表达后,HeLa细胞发生显著的G2/M期阻滞;MTT检测结果表明,400nmol/L的Skp2的反义寡核苷酸能明显抑制HeLa细胞的增殖活性;Western印迹结果表明,HeLa细胞中Skp2可能通过负调控p21WAF的稳定性来参与G2/M检查点调控,这在用放线菌素D处理HeLa细胞的实验中得到验证.这些结果初步揭示了Skp2参与HeLa细胞G2/M周期检查点调控的分子机制.     

人外周血活化淋巴细胞survivin基因的转录激活和表达相关的信号转导通路研究

Survivin是与细胞增殖和细胞凋亡调控密切相关的重要功能蛋白质,也是肿瘤临床诊断的分子标志物及治疗研究的理想靶标.由于发现人外周血活化淋巴细胞存在Survivin蛋白的显著表达,故以植物血凝素(PHA)和IL-2共刺激培养的正常人外周血单个核细胞为实验材料,采用RT-PCR、蛋白质印迹以及细胞周期分析等实验方法,观察淋巴细胞活化与Survivin蛋白表达之间的相互关系,并利用3种激酶抑制剂探索了淋巴细胞活化所致Survivin蛋白表达相关的信号转导通路.实验结果表明：人外周血单个核细胞在刺激培养36 h前后出现survivin基因的明显转录激活和蛋白质的起始表达,表达产物的水平随培养时间的延长而增加,且具有明显的细胞周期和周期时相依赖性.JAK2的抑制剂AG490阻断细胞周期的运行,且强烈抑制survivin基因的转录激活和蛋白质表达,PI3K和MEK的抑制剂Wortmannin和PD98059也有一定程度的抑制作用.所得实验结论是：survivin基因的转录激活和蛋白质表达与淋巴细胞活化相关联,代表细胞处在增殖状态.JAK2介导的JAK-STAT信号通路是淋巴细胞活化,Survivin蛋白表达必需和最重要的信号转导通路,PI3K和MEK介导的信号通路也具有一定的影响作用.     

DNA损伤反应中细胞周期检查点蛋白p27~(Kip1)表达及其调控机制

为了研究DNA损伤反应中p2 7Kip1的表达及其调控机制 ,应用免疫印迹的实验结果表明 :10Gy 60 Coγ射线照射后 3h ,HeLa细胞中p2 7Kip1蛋白水平开始下降并持续到 2 4h ,进而失去它对CDKs的抑制功能 .Northern印迹结果显示 ,电离辐射 (IR)对p2 7Kip1mRNA表达水平无明显影响 ,说明电离辐射诱导p2 7Kip1表达水平的降低主要与蛋白质降解相关 ,但其具体的调控机制还不清楚 .已知在G1—S期p2 7Kip1蛋白的降低主要依赖细胞周期蛋白E Cdk2激酶将其磷酸化后的泛素化蛋白酶体途径 (ubiquitin proteasomepathway) .酶动力学研究结果揭示 :电离辐射后细胞周期蛋白E Cdk2激酶活性增高 ,12h细胞周期蛋白E Cdk2激酶活性达到最大 .当在照前用细胞周期蛋白E Cdk2抑制剂olomoucine (10 μmol L)抑制细胞周期蛋白E Cdk2激酶活性时 ,p2 7Kip1蛋白表达水平增加 .此外 ,还观察到电离辐射可诱导p2 7Kip1泛素化水平的增高 ,而在使用蛋白酶体抑制剂MG 132 (5 μmol L)处理HeLa细胞后 ,可抑制辐射诱导p2 7Kip1蛋白水平的下调 .研究结果提示 :泛素化蛋白酶体途径参与了辐射诱导P2 7Kip1蛋白表达下调的降解机制 .     

电转移中蛋白质的透膜现象及其对蛋白质印迹结果的影响

探讨了电转移中蛋白质的透膜现象及其对蛋白质印迹结果的影响.采用抗凋亡抑制蛋白-Survivin的抗体,对细胞裂解液进行蛋白质印迹.与常规操作方法不同之处是：在电转移的凝胶“三明治”中,重叠放置两张硝酸纤维素膜.电转移后,对两张膜同时进行免疫印迹.在特定的转移条件下,两张膜的免疫印迹都出现了Survivin蛋白的特异印迹带,证实了电转移中存在着蛋白质的透膜现象.转移时间、电流强度和蛋白质的分子质量,都是影响蛋白质透膜的相关因素.电转移中蛋白质的透膜,可以产生“印迹复制失真”的效应,从而最终影响蛋白质印迹定性和定量的结果.所得实验结果和结论,揭示了蛋白质印迹技术方法学中一个需要加以充分关注的问题,对于科学掌握和应用该技术具有积极作用.     

靶向Survivin的反义寡核苷酸对肿瘤细胞增殖的抑制作用

 Survivin是新近克隆的一种凋亡抑制蛋白 (IAP)家族成员 ,在几乎所有肿瘤组织中特异性表达 ,而在正常成年终末分化组织中低表达甚至不表达 .采用四唑盐 (MTT)比色实验法比较 2 0条抗人survivin反义寡核苷酸对HeLa细胞增殖的抑制效果 ,并从中筛选效果显著的反义寡核苷酸 ,在体外水平进一步验证其抑制survivin表达的能力 .在用 4 0 0nmol L反义寡核苷酸转染HeLa细胞 4 8h后 ,有 4条反义寡核苷酸对细胞增殖的抑制率超过 4 0 %,其中 4 5号反义寡核苷酸的抑制率可达5 9%,而阳性对照序列ISIS2 372 2的抑制率仅达 30 %.Northern和Western印迹分析证明 :4 5号反义寡核苷酸可明显降低细胞中survivin基因的mRNA含量和蛋白水平 .4 5号反义寡核苷酸还可在较低浓度 (2 0 0nmol L)显著增强HeLa细胞对化疗药三尖杉酯碱的敏感性 .因此 ,4 5号反义寡核苷酸有望应用于survivin高表达肿瘤的辅助治疗之中     

一种新型的可调控性真核表达载体

最近Gossen等报道了一种新型的可调控性真核表达载体,其主要特点是在真核启动子的上游融合了四环素操纵子结构,通过控制四环素操纵子的开启(on/off)从而启动转录的开始,使得外源基因获得表达。这种结构在转基因动物及基因治疗上有着良好的应用前景。 四环素操纵子结构的开启是在四环素衍生物如强力霉素等的作用下,四环素转录激活物