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对猴头菌Hericium erinaceus原生质体制备的各种因素进行比较研究,结果表明,猴头菌原生质体制备的最佳体系为:液体培养5d的猴头菌丝,以0.6mol/L KCl作为稳渗剂,加入含1.0%纤维素酶+1.0%蜗牛酶+1.0%溶壁酶的复合酶,在30℃酶解猴头菌丝3h时,原生质体得率达到3.0×106个/mL。潮霉素敏感性测试表明,猴头菌在PDSA固体培养基上的潮霉素最低筛选浓度为60μg/mL。采用PEG介导的原生质体法,将质粒pBgGI-hph(含有灵芝gpd1-Gl启动子和潮霉素抗性基因hph)转化猴头菌原生质体,经潮霉素初步筛选以及PCR鉴定,表明有4株猴头菌拟转化子的基因组扩增出hph基因;转化子经过多次转接后进行Southern杂交验证,结果表明4个转化子的基因组中均稳定整合了hph抗性基因。 相似文献
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真菌漆酶异源表达研究进展 总被引:3,自引:0,他引:3
由于漆酶能够氧化芳香类化合物和其它一些非芳香类有机物,具有广泛的底物特异性,因此在纸浆漂白、纺织品染料脱色、有毒废弃物的去除、生物修复和生物传感器等方面具有巨大的应用潜力。但是缺少大量廉价的酶源供应阻碍了漆酶商业化的应用,解决这个问题的一个主要方法就是通过漆酶的异源表达来获得大量的漆酶。综述了真菌漆酶在酵母表达系统和丝状真菌表达系统中表达的研究结果,着重总结了影响漆酶异源表达的因素和提高漆酶表达的策略。 相似文献
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紫杉二烯是紫杉醇合成途径中的前体物质。紫杉醇是红豆杉的一种重要的次级代谢产物,是一种重要的新型抗癌药物。然而,紫杉醇在植物中含量低且难提取,限制了高效应用。利用基因工程手段,借助担子菌类真菌灰盖鬼伞具有的内源类异戊二烯合成途径,构建含有牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(Geranylgeranyl diphosphate,GGPP)合酶和紫杉二烯合酶的融合基因表达载体p Bg GGTS和独立表达盒表达载体p Bg GGg TS,并分别转入灰盖鬼伞LT2菌株中,经过选择性筛选、PCR鉴定、Southern blotting杂交验证,分别获得了5株融合表达的灰盖鬼伞工程菌和5株独立表达盒的灰盖鬼伞工程菌株。各随机挑选了1株工程菌株,分别提取菌丝体和发酵液分析。GC-MS分析表明,两种工程菌株与原出发菌株的菌丝提取物无明显差异峰,而与出发菌株的发酵液提取物相比,两种转基因灰盖鬼伞的发酵液中均出现了明显的差异峰,采用GC-MS特征质量离子分析方法判定为紫杉二烯,分别为44 ng/L(转化p Bg GGg TS)和30 ng/L(转化p Bg GGTS)。结果表明,通过在灰盖鬼伞融合基因或各自独立表达的形式共表达ggpps和ts基因,可以生物合成紫杉二烯。 相似文献
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采用cDNA-AFLP和RACE技术从小白菜中克隆得到泛素结合酶E2基因(ubiquitin conjugating enzyme E2),命名为BcUBCE2。序列分析表明,BcUBCE2基因cDNA全长830bp,包含1个456bp的开放阅读框,编码152个氨基酸。结构分析发现,该序列包含一个泛素结合酶E2活性位点和一个高度保守的半胱氨酸。进化分析显示,小白菜BcUBCE2蛋白同拟南芥E2蛋白的亲缘关系最近。qRT-PCR分析表明,BcUBCE2基因在小白菜根、茎、叶中均有表达,铜处理10d时BcUBCE2基因的表达量最高。研究认为,BcUBCE2基因可能在铜胁迫响应中发挥重要作用。 相似文献
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对中国重要药用植物南方红豆杉中的10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10-乙酰转移酶(DBAT)基因进行分离、测序以及生物信息学分析。根据GenBank中已登录的10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10-乙酰转移酶(DBAT)基因cDNA序列设计引物,采用RT-PCR技术从南方红豆杉叶片中克隆了1个DBAT基因Tc-DBAT的全长cDNA。结果显示,Tc-DBAT cDNA含有1个1 323 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),编码440个氨基酸,对应基因组序列含有1个内含子。Tc-DBAT蛋白N端含有5个N-酰基化作用位点和2个保守的N-糖基化作用位点,具有1个保守的B ig-1结构域,多个重要的磷酸化位点以及1个类似钙结合蛋白重复结构。序列同源性比较、系统发生分析以及蛋白质高级结构预测均表明,Tc-DBAT属于转移酶超家族(transferase superfamily),是一个具有乙酰转移酶活性的功能蛋白,能够催化10-去乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DAB)10位的乙酰化,从而生成抗癌新药紫杉醇生物合成途径中的最后一个双萜中间体——巴卡亭Ⅲ。有望通过成功克隆和鉴定紫杉醇生物合成途径中的关键酶基因达到提高其半合... 相似文献
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抗冷冻蛋白基因遗传转化草菇的研究 总被引:10,自引:0,他引:10
采用RT PCR技术从瑞典的北极云杉卷叶蛾幼虫中扩增出抗冷冻蛋白基因 ,利用基因枪法遗传转化草菇。PCR检测和Southern杂交结果证明 ,抗冷冻蛋白基因已整合进草菇基因组。低温胁迫试验结果表明 ,转基因草菇具有较强的耐低温能力。转基因草菇生物学特性观测结果显示 ,大多数草菇转化子的生长速率明显地慢于对照的宿主菌株 ,多数转化子的菌丝也明显地比宿主菌丝细弱。转化子筛选结果表明 ,采用三轮的转化子筛选程序 ,即第一轮在固体培养基上筛选、第二轮和第三轮在液体培养基中筛选 ,有利于获得真实转化子和淘汰假转化子。转基因草菇一代低温胁迫结果证明 ,转基因草菇后代仍然具有较强的低温耐受能力 ,这说明转基因草菇的耐低温性能在世代之间是稳定的 相似文献
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3′-N-去苯甲酰-2-脱氧紫杉醇苯甲酰转移酶(DBTNBT)是催化紫杉醇生物合成最后一步反应所需要的酶,负责将带有不完全侧链的紫杉醇前体催化形成紫杉醇。利用蔓地亚红豆杉的总DNA和总RNA为模板,采用PCR和RT-PCR技术克隆出DBTNBT基因的DNA序列和cDNA序列,测序结果显示长度分别为1465bp和1362bp,编码438个氨基酸的多肽。同源性比较分析结果表明,其碱基序列与已经报道的蔓地亚红豆杉的DBTNBT基因的一致性为99%,其氨基酸序列与已经报道的蔓地亚红豆杉的DBTNBT氨基酸序列的一致性为96%。DNA序列和cDNA序列比对发现该基因含有1个内含子。利用SWISS-PROT、DNAMAN等生物信息学工具对其蛋白序列进行了分析,为利用基因工程的方法生产紫杉醇或其前体物质提供了分子基础。 相似文献