副猪嗜血杆菌ompP2 基因的结构特征及其与毒力的联系

副猪嗜血杆菌ompP2 基因存在两种结构类型, 但其生物学意义人们还不清楚. 本实验
旨在进一步分析副猪嗜血杆菌ompP2 基因的结构特征并研究其与毒力的联系. 测序结果表明,
与参考菌株血清1, 3, 6, 7, 8, 9, 11 型相比, 19 株临床分离株及血清型2, 4, 5, 10, 12, 13, 14, 15 的
参考菌株的ompP2 基因存在两处连续碱基缺失, 分别位于450~524 和770~844 bp 范围内, 共
计100 bp 左右, 对81 株临床分离株的PCR 检测进一步证实此结果. 序列分析发现, 由于碱基
的连续缺失导致ompP2 基因表面暴露环减少一个, 但却使暴露于膜外的抗原决定簇个数增加,
并且临床分离株和所有毒力参考菌株中均有一个相同的、无毒菌株所没有的膜表面抗原决定簇
VTDQ(K)ALGVGL, 提示暴露于膜外的抗原决定簇可能与毒力相关. 构建两种基因结构类型
的真核表达载体转染Marc145 细胞, 结果显示碱基缺失的血清5 型ompP2 基因编码蛋白的细
胞毒性显著强于血清11 型, 首次证明ompP2 基因结构特征与毒力的关系.     

腺病毒载体介导的GFP基因在鸭胚成纤维细胞中的表达及RNA干扰

目的：建立在鸭胚成纤维细胞（DEF）中进行RNA干扰（RNAi）的技术平台,为鸭基因组功能的研究提供新的技术手段。方法：以绿色荧光蛋白（GFP）基因为报告基因,脂质体转染化学合成的GFP特异小干扰RNA（GFP-siRNA）,用流式细胞仪测定GFP-siRNA对重组腺病毒（Adv-GFP）介导的GFP基因在DEF中表达的干扰效果。结果：200MOI（感染复数）Adv-GFP介导的GFP基因在DEF中表达效率最高,为31．20％±3．1l％,对DEF的活力无明显影响;GFP-siRNA能有效干扰GFP基因在DEF中的表达,相对抑制率为98．56％。结论：在DEF中进行RNAi是可行的,Adv-GFP是介导外源基因在DEF中表达较为理想的载体;首次建立了在DEF中进行RNAi的技术平台,为鸭基因组的功能等研究提供了新的技术手段。     

山羊乳上皮黏蛋白MUC1基因和蛋白多态性的研究

本研究的目的 是从基因水平上检测四川省地方山羊品种乳上皮黏蛋白MUC1的遗传多态性.根据GenBank中山羊MUC1部分基因序列设计引物,用PCR方法扩增出山羊MUC1基因的不同数目串联重复区,长度为1.7～2.2 kb.在4个地方山羊品种(品系)中共检测到3个乳MUC1等位基因和5种基因型,其中纯合型的比例高,基因型和基因频率存在品种(品系)间的差异.本研究为检测山羊乳MUC1遗传多态性提供了可靠的方法.     

QS系统中LasR和RhlR蛋白对铜绿假单胞菌生物被膜形成的影响以及免疫原性研究

为探讨铜绿假单胞菌 PAO1 中 lasR 和 rhlR 基因表达产物的分子生物学特性,研究它们对铜绿假单胞菌生物被膜形成的影响以及对小鼠的免疫保护效果,采用聚合酶链式反应 (PCR) 方法扩增铜绿假单胞菌标准株 PAO1 中的 lasR 和 rhlR 基因,全自动荧光测序仪测序,并用 Blast 方法检测克隆片段. 利用 pGEX4T-1 载体分别构建 lasR/rhlR-pGEX4T-1 重组质粒,在大肠杆菌 BL21(DE3)中诱导表达,并经过免疫印迹实验验证其生物学活性. 用硅胶膜培养法建立生物被膜模型,诱导转入了pGFPuv 质粒的铜绿假单胞菌 PAG0305 形成生物被膜,并测定 LasR 蛋白和 RhlR 蛋白对生物被膜形成的影响. 同时用纯化的重组蛋白免疫小鼠,菌落计数法检测免疫组和对照组鼠肺对铜绿假单胞菌的清除率. 以 PAO1 染色体 DNA 为模板的 PCR 结果显示,lasR 的全基因序列为 720 bp,rhlR 基因序列为 726 bp,经序列分析和同源性比较分别与 GenBank 中 lasR/rhlR 基因(登录号:M59425; AE004768) 的同源性为 100%. 大肠杆菌 BL21 (DE3) 分别转化重组质粒 lasR/rhlR-pGEX4T-1 后,经 IPTG诱导和 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,表达的融合蛋白分子质量均为 54 ku 左右,与预期蛋白质分子质量相同. 荧光显微镜观察和测定结果表明,在硅胶膜上 PAG0305 能够形成典型的发荧光的生物被膜,LasR 或 RhlR 蛋白 (10 mg/L) 存在的情况下,PAG0305 生物被膜的形成速度在前三天比对照组平均提高 40.77%,而且两蛋白单独存在与同时存在时的作用相同. 体内实验中,免疫小鼠肺部对铜绿假单胞菌的清除率显著高于未经免疫的正常组 (P < 0.05). 上述结果表明:构建的lasR/rhlR-pGEX4T-1 重组质粒能够在大肠杆菌 BL21(DE3)中成功地表达并具有生物学活性. LasR/RhlR 蛋白在体外模型中能够加快铜绿假单胞菌生物被膜的形成速度,是调节铜绿假单胞菌生物被膜形成的重要因素之一. 免疫结果表明,重组蛋白对小鼠表现出一定的保护作用,这为进一步开展疫苗研究奠定了基础.