RNAi技术在昆虫功能基因研究中的应用进展

RNA干扰（RNA interference,RNAi）是指外源或内源的双链RNA（dsRNA）特异性地引起基因表达沉默的现象,它作为一种有效的工具用来产生转录后沉默,从而抑制特定基因的表达,成为基因功能研究的一种新方法,除了在模式昆虫如果蝇Drosophila中广泛应用之外,也在非模式昆虫中得到成功应用。近年来,RNAi技术在导入方法和基因功能分析方面都取得了飞速发展,且与转基因技术相结合成功应用于害虫防治领域。本文综述了RNAi技术在导入方法、昆虫功能基因组功能分析及害虫防治等领域新近的研究成果,并展望了该技术的应用前景。     

利用RNAi技术沉默小菜蛾类钙粘蛋白基因

RNA干扰（RNA interference, RNAi）是一种调控基因表达的方法, 其通过体外合成一段与内源靶基因同源的双链RNA（dsRNA）或siRNA, 导入生物体内, 使内源靶基因中同源mRNA降解, 从而达到阻抑基因表达的目的。类钙粘蛋白（cadherin-like protein）是位于昆虫中肠刷状缘膜囊(brush border membrane vesicles, BBMV)上与钙粘蛋白(cadherin)结构相似的物质, 是多种昆虫体内Bt杀虫蛋白的受体。本研究利用基因特异引物通过RT-PCR扩增了小菜蛾类钙粘蛋白基因的2个片段（CAD1和CAD2）, 合成相对应的双链RNA（double-stranded RNA, dsRNA）; 并将dsRNA通过显微注射导入小菜蛾3龄幼虫体内, 测定了不同靶位点、不同剂量、不同检测时间对目的基因mRNA表达量的影响。结果表明: 将70 nL CAD1对应的dsRNA注射到幼虫体内48 h后, 基因表达量显著下降, 72 h后恢复。免疫印迹检测结果表明, 类钙粘蛋白在注射dsRNA 48 h后幼虫BBMV中的含量明显下降。本实验成功实现了小菜蛾类钙粘蛋白基因的沉默, 该体系的成功建立为利用RNAi技术分析小菜蛾及其他鳞翅目昆虫基因的功能提供了参考。     

我国甜菜夜蛾间歇性暴发的非均衡性循环波动

[摘要] 为进一步了解我国甜菜夜蛾Spodoptera exigua ( Hbner)间歇性暴发成灾的规律,作者应用时间序列分析技术研究了我国甜菜夜蛾间歇性暴发的时间序列波动规律。结果表明,在1949—2008年的60a中,我国甜菜夜蛾大尺度暴发总年频次为120次,各年度暴发次数(年频次)存在着非均衡性循环波动特征,并且在其波动过程中呈明显的上升趋势。按“年频次”强度,可将我国1949—2008年60a中甜菜夜蛾发生过程,划分成两个明显不同的阶段。第一阶段（1949—1984年）为平稳低发阶段,36a总年频次量为4次,年平均仅0.11次;第二阶段（1985—2008年）则为波浪式上升性高发阶段,24a总年频次为116次,年平均4.83次（为第一阶段的43.91倍））。按第二阶段24a（1985—2008）数据进行自相关系数和频谱图分析,结果表明,我国甜菜夜蛾大尺度暴发存在2.8a和11.2a2种不同长度的循环周期,其暴发趋势指数对滞后1a和滞后4a的影响为正相关,而对滞后5a和滞后6a的影响则为负相关。本文根据甜菜夜蛾暴发指数的非均衡周期性特征,建立了以时间序列为自变量的甜菜夜蛾暴发指数非均衡周期性预测模型,经回代结果检验,理论值与实测值之间无显著差异。     

PxCAD1与Cry1Ac蛋白混合物对小菜蛾生长发育及体内酶活性的影响

[目的]PxCAD1肽段可显著增强Cry1Ac的杀虫活性,探究其与Cry1Ac混合物对靶标昆虫生物学及体内酶活性的影响对明确其增效机制具有重要意义.[方法]采用叶片浸渍法,以PxCAD1肽段与Cry1Ac毒素的混合蛋白饲喂小菜蛾Plutella xylostella3龄幼虫,观察并统计小菜蛾死亡率、化蛹率和羽化率,并测定小菜蛾幼虫体体内羧酸酯酶、谷胱甘肽-S-转移酶、总蛋白酶和类胰蛋白酶的变化趋势.[结果]与对照相比,处理组幼虫的死亡率显著升高,化蛹率减少,羽化率显著降低;3龄幼虫在取食PxCAD1肽段与Cry1Ac毒素混合蛋白24 h和48 h后,羧酸酯酶活性显著升高,72 h显著降低,谷胱甘肽-S-转移酶活性在24 h显著升高,48 h显著降低,72 h则无显著差异,而总蛋白酶活性仅在72 h显著低于对照,类胰蛋白酶活性在各时间点无显著变化.[结论]PxCAD1不仅对Cry1Ac具有显著增效作用,同时对小菜蛾幼虫的生长发育及体内羧酸酯酶、谷胱甘肽-S-转移酶及总蛋白酶的活性产生不利影响.该结果将有助于进一步研究中肠受体蛋白对Cry1Ac的增效机制.     

取食Bt棉与玉米的越冬代棉铃虫抗寒性特征比较

【目的】针对由Bt棉花和玉米构成的华北农田景观, 探讨不同寄主作物对棉铃虫 Helicoverpa armigera 越冬抗寒的影响。【方法】2013年在河北廊坊科研中试基地的作物田中将棉铃虫幼虫接到Bt棉和玉米上, 比较取食不同作物后棉铃虫的化蛹率、存活率和越冬蛹羽化率;在室内控制条件下分别用棉蕾和鲜玉米粒饲喂棉铃虫幼虫。 测定滞育蛹和非滞育蛹的鲜重、干重、以及脂肪、糖原和低分子物质含量等指标, 比较取食不同作物后棉铃虫的抗寒能力。【结果】取食玉米的棉铃虫滞育蛹干重（117.5 mg）、脂肪含量（457.2 μg/mg DW）以及海藻糖浓度（86.45 μg/g）均显著高于取食Bt棉的棉铃虫滞育蛹干重（56.6 mg）、脂肪含量（239.6 μg/mg DW）以及海藻糖浓度（13.87 μg/g）;取食玉米的棉铃虫冰点(-10.2℃)显著低于取食Bt棉的棉铃虫冰点(-6.5℃)。【结论】结果表明取食玉米更加有利于棉铃虫越冬。 据历史数据, 近年来玉米种植面积不断增加, 这将提高棉铃虫成功越冬比率, 对棉铃虫种群扩张起到促进作用, 因此注重玉米上棉铃虫的防治尤为重要。     

烟粉虱对四种蔬菜寄主的选择性

为探讨利用趋避作用防治烟粉虱的可能性,进行了3方面试验：1）烟粉虱Bemisia tabaci (Gennadius) 对黄瓜、花椰菜、油菜和莴苣等4种蔬菜的寄主选择性; 2）互喷烟粉虱不同嗜好的寄主植物汁液对其寄主选择性的影响; 3）不同间作方式对黄瓜叶上烟粉虱成虫密度的影响。结果表明,烟粉虱对供试植物有明显的选择性,其嗜好程度为花椰菜>黄瓜>油菜>莴苣。喷施莴苣和花椰菜汁液对烟粉虱的寄主选择性均有显著影响,喷施莴苣原液后,花椰菜和黄瓜上的成虫数分别减少79.6%和87.4%,花椰菜上的着卵量减少84.3%;喷施花椰菜原液后,莴苣上的成虫数和着卵量分别增加82.4%和79.2%,表明不同蔬菜中的内含物是引起烟粉虱对寄主选择性的重要原因。在黄瓜中间作莴苣可使黄瓜叶上烟粉虱成虫数平均减少76.5%;间作花椰菜时,通过诱集作用,也可使黄瓜叶上的成虫数平均降低69.7%。这些结果为利用喷施蔬菜汁液和间作方式控制烟粉虱危害提供了理论依据。     

极端高温和持续中等高温对小菜蛾耐热性的影响

气候变化频率的增加和持续时间的延长,导致具有较短生活史的大部分农业害虫的某一个或某几个生命阶段都可经历热浪的胁迫。热浪对小型昆虫的生态学效应取决于不同生命阶段的耐热性,因而解析特定龄期下昆虫生命阶段的耐热性对理解气候变暖热浪频发的生态学影响具有重要意义。本研究以世界重要蔬菜害虫小菜蛾为研究对象,试验了小菜蛾4龄幼虫、成虫的基底耐热性和诱导耐热性,以及1龄幼虫和3龄幼虫置于不同高温[(31±1)、33±1)、35±1)℃]和暴露时间(3、6、9、12d)组合的持续中等高温耐热性。试验发现幼虫和成虫具有不同的基底和诱导耐热性,具有较弱基底耐热性的幼虫反而具有更强的诱导耐热性。不同生命阶段在持续数天的中等高温胁迫下具有不同的存活表现,早期生命阶段存活率较后期阶段的低,而且这种差异在较强高温下表现得尤为明显。昆虫不同阶段耐热性的差异,对种群的维持具有重要的生态学意义。大多数农业害虫田间种群具有混合年龄结构,热浪后耐热的发育阶段的存活,保证种群可以一直生存和繁衍下去。     

我国甜菜夜蛾间歇性暴发频度的大尺度地理差异及其成因分析

【目的】为探索我国甜菜夜蛾Spodoptera exigua(Hübner)间歇性大暴发频度的大尺度地理差异及其成因,作者研究和分析了我国1956—2008年52年间共发生的121次甜菜夜蛾大暴发频次地理分布的行政区域特征、纬度特征和经度特征。【方法】首先查阅和整理我国历代以来有关甜菜夜蛾记载和研究的文献,并按时间序列方式进行归纳和总结,得出中国1956—2008年52年间共发生甜菜夜蛾大暴发频次为121年次,然后分别按中国省级行政区域、纬度分级区域和经度分级区域进行重新整理分析,在此基础上,进一步细分出中国不同省区及不同经纬度地区甜菜夜蛾有暴发记录的历年总频次数,然后进行统计分析。【结果】分析结果表明:按省级行政区域进行统计,中国有17省(直辖市)有甜菜夜蛾暴发的记录;按暴发频次多少可分为低频暴发区(记录1~4次的共有8省市,即天津1、北京1、海南1、湖南1、云南2、广西3、辽宁3、福建3)、中频暴发区(记录5~9次的共有5省市,即湖北5、安徽7、上海8、江西8、陕西8,占总频次的29.8%)和高频暴发区(记录10次以上的4省市,即山东10、河南13、浙江13、江苏34,占总频次的58%)。按经纬度值进行统计,中国甜菜夜蛾有暴发记录的纬度范围为21.44°~41.97°N,即从中国南部的福建莆田至北部的辽宁抚顺都有甜菜夜蛾暴发的记录,经度范围为107.09°~123.97°E,即从中国西部的陕西关中至东部的辽宁抚顺都有甜菜夜蛾暴发的记录。而暴发最频繁的纬度范围是28°~38°N,约占总频次的89.3%;暴发最频繁的经度范围是113°~121°E,约占总频次的81.8%。【结论】中国甜菜夜蛾间歇性暴发区以华北平原和长江中下游平原地区为主,暴发寄主以蔬菜和棉花为主,暴发季节以7—10月为主。甜菜夜蛾间歇性高频暴发区,其地理特征主要为低海拔地区,即平均海拔低于500 m(也有极少部分发生在平均海拔为1 000~2 000 m之间的盆地);其气候特征主要为暖温带3 400℃≤活动积温≤4 500℃及亚热带地区4 500℃≤活动积温≤8 000℃、湿润(年降水量≥800 mm)及半湿润地区(400≤年降水量≤800 mm)和亚热带及温带季风气候区(该两个气候区的共同特点是夏季高温多雨,冬季低温少雨或寒冷干燥)。     

害虫Bt抗性机制研究新方向：昆虫体液免疫系统

作为最成功的生物农药,苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis (Bt)杀虫剂已在农业生产中应用了约80年。Bt由于其特异性强、安全高效的特点而得到广泛、成功的应用,极大减少了化学农药的用量,为环境保护作出了巨大贡献。然而,由于长期使用,一些靶标害虫逐渐对Bt产生抗性。本文对昆虫体液免疫及昆虫Bt抗性机制的研究成果进行了总结,已有研究认为害虫对Bt产生抗性的主要原因是毒素激活受阻及(或)毒素受体突变或减少。然而近年越来越多的研究表明,昆虫的Bt抗性还与其免疫系统,特别是与Toll, IMD和proPO-AS等体液免疫通路有关。由此,本文对昆虫体液免疫系统参与昆虫Bt抗性形成的主要通路进行了归纳和推论。IMD免疫通路可能通过MAPK信号通路参与调节昆虫Bt抗性,或可能通过多种免疫反应对抗因中肠组织被Bt破坏而引起的败血症,并通过JNK信号通路促使中肠组织愈合,进而提高其对Bt的抗性。从体液免疫系统切入研究,可能成为深入探索昆虫Bt抗性机制的新方向。     

三种稻田常见螯蜂对半翅目害虫的寄主偏好性及控害作用

【目的】探明两色食虱螯蜂Echthrodelphax fairchildii、黄腿双距螯蜂Gonatopus flavifemur和稻虱红单节螯蜂Haplogonatopus apicalis 3种稻田常见螯蜂对半翅目害虫的寄主偏好性及控害作用。【方法】在非选择条件下,分别以褐飞虱Nilaparvata lugens、白背飞虱Sogatella furcifera、灰飞虱Laodelphax striatellus、黑尾叶蝉Nephotettix cincticeps和伪褐飞虱Nilaparvata muiri为寄主,观察两色食虱螯蜂、黄腿双距螯蜂和稻虱红单节螯蜂的取食、寄生以及子代生长发育情况;并在选择条件下观察3种螯蜂对稻飞虱的寄主选择性,评价螯蜂的寄主偏好性。根据以上试验,评出3种螯蜂各自的适宜寄主;并选择适宜寄主测定3种螯蜂的寿命、取食量和寄生量,评价其控害作用。【结果】两色食虱螯蜂可取食和寄生褐飞虱、灰飞虱、白背飞虱和伪褐飞虱,以前3种为两色食虱螯蜂的适宜寄主,伪褐飞虱次之;黑尾叶蝉为其非取食、寄生寄主。黄腿双距螯蜂可取食和寄生4种飞虱：褐飞虱和灰飞虱适合性较高,白背飞虱次之,伪褐飞虱最差。黑尾叶蝉可为黄腿双距螯蜂的取食寄主,但非寄生寄主。稻虱红单节螯蜂以白背飞虱为最适寄主,灰飞虱次之;其他3种寄主仅能被稻虱红单节螯蜂取食,不能被成功寄生。在适宜寄主上,稻虱红单节螯蜂雌虫的寿命、总取食和寄生合计量均最高,两色食虱螯蜂的最低,黄腿双距螯蜂的居中;3种螯蜂日均取食量和寄生量的消长动态波动幅度不大。【结论】两色食虱螯蜂偏好寄生褐飞虱、灰飞虱和白背飞虱,控害作用相对最弱;黄腿双距螯蜂偏好寄生褐飞虱和灰飞虱,控害作用居中;稻虱红单节螯蜂偏好寄生白背飞虱,控害作用最强。