斜纹夜蛾核多角体病毒Spit119基因在大肠杆菌中的表达及抗体制备

用PCR的方法扩增得到斜纹夜蛾核多角体病毒(Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus,SpltMNPV)ORF119全长基因(Splt119),将其克隆至5'端有6 × His编码序列的原核表达栽体pQE30上,转化大肠杆菌M15[pREP4],在1 mmol/LIPTG诱导下超量表达了一个分子量约28 kD的融合蛋白.经聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化,免疫新西兰大白兔制备了特异的抗Splt119抗体.Western blotting免疫印迹分析表明,该抗体适合用作Splt119蛋白功能的进一步研究.     

假单胞菌M18中藤黄绿菌素合成限速酶基因的鉴定及表达优化

【目的】假单胞菌株M18中负责抗真菌剂藤黄绿菌素(Plt)合成的结构基因包括pltLABCDEFG、pltM。为了鉴定Plt合成限速酶的基因,分别将9个结构基因过表达。【方法】以M18菌株染色体DNA为模板,PCR扩增这9个Plt合成基因的编码区,分别克隆到穿梭载体pME6032的tac启动子下游,构建9个结构基因的过表达载体,并转入假单胞菌株M18中。在KMB培养基中进行Plt发酵分析。【结果】分别携带pltC、pltD、pltF过表达载体的菌株与携带空质粒的菌株相比,Plt产量分别提高了96%、78%、75%。对重组菌株进行IPTG诱导浓度和诱导时间的优化,确定IPTG最佳诱导浓度为1.0 mmol/L,最佳诱导时间为培养6 h。【结论】pltC、pltD、pltF分别编码的Ⅰ型聚酮合成酶、卤化酶、乙酰CoA合成酶可能为Plt生物合成的限速酶。按照优化条件发酵,携带pltD、pltF过表达质粒的菌株产量分别上升77.5%、159.1%。     

昆虫抗菌肽的研究进展

昆虫抗菌肽是昆虫免疫后存在于血淋巴中的一类肽类活性物质.具有相对分子质量小、热稳定性强、无免疫原性、抗菌谱广等特点.结合昆虫抗菌肽的研究现状和发展前景,对昆虫抗菌肽的分类、作用机理、基因工程等方面进行了综述.     

细菌源吡咯里西啶类生物碱的发现及生物合成研究进展

吡咯里西啶类生物碱(Pyrrolizidine Alkaloids,PAs)在高等植物中分布广泛,目前超过6000种植物产生了650余个PAs。源于细菌的PAs发现较少,其中ClazamycinA和ClazamycinB由Umezawa等在1979年报道。近年来在微生物基因组和合成生物学发展的驱动下,细菌源PAs的发现和生物合成的研究方兴未艾。截至目前,已发现12类(60余个)源于细菌的PAs,包括波米西亚胺、Azetidomonamides和Brabantamides,以及含有PAs结构单元的多烯大环内酰胺Ciromicins和Heronamides。对这些结构多样、活性优异的细菌源PAs的研究发现,多数PAs依赖于一对独特的非核糖体多肽合成酶(Non-Ribosomal Peptide Synthetases,NRPSs)/拜耳-维利格单加氧酶(Bayer-Villiger Monooxygenase)生物合成其吡咯双烷基本骨架;而含有β-氨基酸的多烯大环内酰胺中吡咯双烷的形成则可能通过一个高度非对映选择性的电子重排反应途径。微生物基因组挖掘揭示了细菌中有大量沉默的PAs生物合成基因簇,说明细菌PAs在细菌进化和其环境/宿主的适应性中起着重要作用。     

斜纹夜蛾核多角体病毒VP39-GST融合蛋白的原核表达

用PCR的方法扩增得到斜纹夜蛾核多角体病毒（Spodoptera litura multicapsid nucleopolyhedrovirus,SpltMNPV）vp39全长基因。将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1上,构建重组表达质粒pGEX-4T-vp39,转化大肠杆菌BL21（DE3）,在1 mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导下超量表达了与理论预测值相符的一个约60 kD的VP39-GST融合蛋白。VP39-GST融合蛋白的成功表达为进一步研究VP39在病毒侵染过程中与宿主细胞成分或病毒粒子蛋白间的相互作用奠定了基础。     

假单胞菌株M18中pqsA突变株的构建及其对plt的调控

【目的】根际铜绿假单胞菌M18能产生藤黄绿菌素(Plt)和吩嗪-1-羧酸(PCA)两种主要的抗生素。其PqsR/PQS群体感应系统由应答调控蛋白PqsR与信号分子PQS组成。前期研究已经表明pqsR负调控Plt生物合成及基因簇表达。本论文旨在研究PQS分子对Plt合成及基因表达的调控作用。【方法】从M18基因组中扩增PQS合成基因pqsA,通过同源重组技术构建假单胞菌M18的pqsA突变菌株M18pqsA。利用lacZ报告基因分析、信号分子添加实验等,研究PQS对Plt合成及基因表达的调控作用。【结果】在KMB培养基中,分别比较野生型菌株M18和突变菌株M18pqsA的Plt产量,突变菌株的Plt产量存在较小幅度的升高,约为野生型菌株的1.53倍。添加PQS对plt表达存在一定程度但不是很显著的负调控作用。【结论】PQS分子对Plt生物合成及基因表达存在部分负调控作用。     

假单胞菌株M18 psrA突变株的构建及其对吩嗪-1-羧酸和藤黄绿菌素合成的调控

【目的】假单胞菌M18是一株能同时合成吩嗪-1-羧酸(PCA)和藤黄绿菌素(Plt)两种抗生素的植物根际促生细菌。PsrA为细菌TetR家族转录调控因子。为了研究PsrA对PCA与Plt生物合成的影响,从M18菌株基因组中扩增psrA基因。【方法】通过同源重组技术,构建庆大霉素抗性片段置换psrA的突变菌株M18psrA。利用基因互补、lacZ报告基因融合分析实验,验证PsrA对抗生素合成基因的调控作用。【结果】在PPM和KMB培养基中,分别比较野生型菌株M18和突变菌株M18psrA的PCA与Plt产量,突变菌株M18psrA的PCA产量显著下降;Plt产量显著升高,为野生型菌株的10-15倍。基因互补、lacZ报告基因融合分析,进一步证明了psrA正调控PCA的phz2合成基因簇,负调控Plt的合成基因簇。【结论】PsrA区别性调控抗生素PCA与Plt的生物合成。     

CellProfiler分析重组杆状病毒转导OL细胞的最佳条件

[目的]定量分析重组杆状病毒在少突神经胶质细胞(oligodendrocyte,OL)中的表达水平,为探索重组杆状病毒最佳转导条件。[方法]首先构建重组杆状病毒,将重组杆状病毒转导至OL细胞,通过荧光显微镜观察细胞形态及EGFP表达情况,并采集细胞的数字图像。利用CellProfiler软件对重组杆状病毒在OL细胞中转导后的表达水平进行数字图像分析,得到各个优化条件的EGFP阳性细胞比率及表达强度,绘制图表并分析。[结果]40MOI重组杆状病毒转导OL细胞并添加10 mmol/L丁酸钠,转导时间为12 h,培养时间为72 h时病毒转导效率最高;培养时间为48 h,其它条件相同情况下EGFP表达强度最高。[结论]定量分析优化后,重组杆状病毒转导OL细胞的表达效率及EGFP的表达水平得到显著上调。     

假单胞菌M18 pqsR突变株的构建及其对藤黄绿菌素合成的调控

假单胞菌M18是一株能同时合成藤黄绿脓菌素(Plt)和吩嗪-1-羧酸(PCA)两种抗生物质的植物根际促生细菌。运用PCR方法, 从M18基因组中扩增得到pqsR基因, 该基因编码LysR家族调控蛋白PqsR。通过同源重组技术, 构建假单胞菌M18的pqsR突变菌株M18PRG。比较野生型菌株M18和突变菌株M18PRG在KMB培养基的Plt产量, 发现M18PRG 菌株合成Plt的量约为野生型M18菌株的3~4倍。在pqsR突变株的反式互补实验中, Plt的产量回复到野生型水平。pltA′-′lacZ翻译融合的测定结果进一步证明PqsR对Plt生物合成基因簇具有负调控作用。分析M18野生型及其pqsR突变株的生长曲线, 发现PqsR对细菌的生长具有抑制作用。另外, 我们还发现pqsR基因调控红色色素的产生。上述结果表明, 在假单胞菌M18中, PqsR作为全局性调控因子参与了细胞内多种生理活动的调控。     

杆状病毒Ac78 C末端保守区域的功能初步分析

杆状病毒模式种苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus, AcMNPV)的orf78 (即Ac78)是最近被发现的杆状病毒核心基因,在杆状病毒的生活周期中具有重要功能.氨基酸序列分析表明,Ac78的C末端105～108位氨基酸区域在Group I NPVs旁系同源物中高度保守.为研究该保守区域在Ac78功能中的作用,利用Bac-to-Bac杆状病毒表达载体系统成功构建了缺失该保守区域,并且携带绿色荧光蛋白基因和多角体蛋白基因的Ac78截短补回型重组病毒(vAc78:del105-108).荧光显微镜分析和病毒生长曲线测定结果表明,在vAc78:del105-108转染的Sf9细胞中,感染性的芽生型病毒粒子(budded virion,BV)产生量与Ac78全长补回型重组病毒(vAc78:HA)基本一致;电镜观察发现,在vAc78:del105-108转染的细胞中,呈现与vAc78:HA的现象一致的典型的杆状病毒感染特征,多粒包埋型病毒粒子(multiple nucleocapsid enveloped occlusion derived virion,M-ODV)以及包埋有M-ODV的包涵体均能正常形成;免疫荧光实验表明,在vAc78:del105-108感染的Sf9细胞中,从病毒感染细胞24 h时开始,Ac78专一定位于感染细胞的内核膜附近,与vAc78:HA的现象一致.上述结果表明,Ac78的C末端105～108位氨基酸保守区域对于BV和M-ODV的有效产生以及Ac78的亚细胞定位非必需.