尺蠖蜕皮激素受体基因Eo-EcR 的克隆、生物信息学分析和表达检测

【目的】蜕皮激素受体（ecdysteroid receptor, EcR）是一种超家族核受体,它能与超气门蛋白USP组成异源二聚体复合物EcR/USP,调节20 羟基蜕皮酮（20E）的生物活性,进而调控昆虫的发育、变态及繁殖等生命过程。本研究旨在克隆茶尺蠖 Ectropis obliqua Prout EcR基因全长,并了解该基因的编码蛋白特征和时空表达模式。【方法】通过RT-PCR方法并结合RACE技术,克隆茶尺蠖EcR的基因全长,通过生物信息学软件和在线网站分析茶尺蠖EcR的生物学特性,通过实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR, qRT-PCR）技术比较茶尺蠖 EcR 在不同发育时期和6龄幼虫不同组织中的相对表达含量。【结果】克隆并鉴定了茶尺蠖EcR基因,将其命名为 Eo-EcR（基因登录号: KP869130.1）,Eo-EcR全长2 268 bp,含有1 728 bp开放阅读框,编码576个氨基酸。系统进化树和氨基酸同源性比对表明,Eo-EcR具有相对保守的进化特性,特别是与鳞翅目昆虫的保守性最高。三级结构模拟和功能结构域预测表明,Eo-EcR具有3个经典的结构模型,并以α螺旋为主,功能位点单一且为C₄型锌指结构。qRT-PCR结果表明,Eo-EcR在5龄和6龄幼虫期以及成虫期表达量较高,在其他龄期表达量变化不大;同时在前胸腺表达量最高,在血淋巴表达量最低。【结论】明确了Eo-EcR的核苷酸序列及编码蛋白特征,明确了Eo-EcR的时空表达特性。该研究结果为进一步研究Eo-EcR的分子功能和基于Eo-EcR为靶标杀虫剂的研制奠定分子基础。     

昆虫RNAi效率的影响因素研究进展

RNA干扰(RNAi)是一种在动植物中广泛存在的、由双链RNA诱发的、导致mRNA特异性沉默的过程.简单总结昆虫RNAi的研究现状,从理论和实践两个方面重点介绍昆虫RNAi效率影响因素的研究进展,最后对昆虫RNAi应用于害虫防治的前景进行展望.     

昆虫miRNAs功能研究进展

miRNA是一类长度在18～25个碱基的具有调控作用的RNA核酸小分子。在各种生物学过程的调控中均起着举足轻重的作用。近年来,随着miRNA研究技术的飞速发展,昆虫miRNA研究取得了许多重要成果。该文主要综述了miRNA在昆虫免疫、生殖、凋亡及神经发育等生物学过程中功能的研究进展,以期为相关研究提供参考。     

联苯菊酯与茚虫威对茶尺蠖中肠细胞结构及血淋巴解毒酶的影响

【目的】茶尺蠖Ectropisobliqua Prout是茶树上的重要害虫,本研究旨在研究茶园常用农药联苯菊酯与茚虫威两种农药对该虫中肠细胞结构及血淋巴酶活性的影响,为日后更好防治该虫提供理论基础。【方法】采用浸梢法在室内测定了5龄茶尺蠖幼虫对联苯菊酯与茚虫威的半致死浓度LC50值。采用LC_(50)浓度药液进一步处理茶尺蠖,通过透射电镜观察了联苯菊酯与茚虫威对茶尺蠖中肠细胞结构的影响,以及血淋巴中谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)、乙酰胆碱酯酶(AChE)和羧酸酯酶(CarE)3种解毒酶的酶活性变化。【结果】联苯菊酯与茚虫威对5龄茶尺蠖幼虫的LC_(50)值分别为5.884 mg.L~(-1)与0.268 mg.L~(-1)。透射电镜显示,中肠柱状细胞的微绒毛大量解体、散乱分布于肠腔中,胞内细胞器向顶膜转移,并发生明显的形变。酶活检测结果表明,经联苯菊酯处理后,GSTs的酶活基本不变,而AchE和CarE的酶活性被显著诱导。经茚虫威处理后,GSTs、AchE和CarE的酶活性均被显著抑制。【结论】联苯菊酯与茚虫威不仅具有破坏茶尺蠖中肠柱状细胞的微绒毛,使各细胞的牢固性与紧密性缺失,还会破坏柱状细胞内部的细胞器功能。联苯菊酯在血淋巴中的解毒代谢与酯酶(AChE和CarE)有关,与转移酶(GSTs)无关,而茚虫威与酯酶(AChE和CarE)和转移酶(GSTs)两者均有关。     

茶尺蠖水通道蛋白EoAQP1的cDNA克隆、多克隆抗体制备及亚细胞定位

【目的】水通道蛋白(aquaporin,AQP)是一种广泛存在于哺乳动物、植物和微生物中的跨膜转运蛋白,它在细胞水分运输、离子选择透过性和渗透压平衡等过程中发挥着重要的作用。本研究旨在分析茶尺蠖Ectropis obliqua Prout水通道蛋白AQP1的基因特性,在制备多克隆抗体的基础上了解其亚细胞定位分布。【方法】采用同源克隆方法并结合RACE技术克隆茶尺蠖AQP1的基因全长,通过生物信息学网站和软件分析茶尺蠖AQP1的生物学信息;通过实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)检测茶尺蠖AQP1在不同发育阶段和6龄幼虫不同组织中的相对表达量;通过原核表达、镍柱纯化并免疫新西兰兔制备了茶尺蠖AQP1的多克隆抗体;通过荧光显微镜观测了茶尺蠖AQP1在黑腹果蝇Drosophila melanogaster胚胎细胞S2中的定位分布,并利用多克隆抗体进行了Western blot验证。【结果】克隆并鉴定了茶尺蠖AQP1全长,将其命名为Eo AQP1(Gen Bank登录号:KT819587),Eo AQP1 c DNA全长1 826 bp,含有780 bp开放阅读框,编码259个氨基酸。系统进化树和氨基酸序列同源性比对表明,Eo AQP1在鳞翅目昆虫中高度保守。跨膜结构和水分渗透模拟表明,Eo AQP1具有经典的水分渗透模型。qRT-PCR结果表明,Eo AQP1在不同发育时期和6龄幼虫不同组织中均有表达且差异显著。亚细胞定位结果表明,Eo AQP1以圆形颗粒状成群聚集于细胞膜周边,而在细胞膜、核膜和细胞质等处均不表达。多克隆抗体Western blot检测结果表明,Eo AQP1多克隆抗体特异性较好,可用于后续相关实验。【结论】获得了Eo AQP1的c DNA序列,明确了Eo AQP1的生物学特征,阐明了Eo AQP1的时空表达特性,成功制备了Eo AQP1多克隆抗体,初步了解了Eo AQP1的亚细胞定位,为进一步研究Eo AQP1的水分渗透机理奠定了分子基础。     

斜纹夜蛾水通道蛋白1（AQP1）基因的克隆、分子特性和表达分析

水通道蛋白(aquaporin, AQP)是生物体中一种重要的跨膜通道蛋白, 它通过一些中性小分子化合物的运输, 从而参与了昆虫对食物中水分再吸收、抗寒和抗干燥等重要生理机制。为研究斜纹夜蛾中水通道蛋白的基因特征和时空表达特征, 本研究利用同源克隆和RACE技术获得了斜纹夜蛾水通道蛋白1（AQP1）基因的两个转录异构体, 并将其分别命名为SL-AQP1A （GenBank登录号： KC999953）和SL-AQP1B （GenBank登录号： KC999954）,其中SL-AQP1B比SL-AQP1A在推导的编码区5′端连续性缺失81个碱基, 而其他序列完全一致; 同源分析显示推导的SL-AQP1与家蚕为代表的水通道蛋白1具有较高的同源性。拓扑学和三级结构模拟显示其有经典的6个全跨膜结构域、2个半跨膜结构域、2个保守的NPA (asparagine-proline-alanine, 天冬氨酸-脯氨酸-丙氨酸)结构基序及选择性水孔构件ar/R （aromatic arginine, 芳香族精氨酸）。qRT-PCR结果显示, SL-AQP1整体时空表达差异性十分明显, 并且SL-AQP1B的表达量显著高于SL-AQP1A; SL-AQP1在卵期和预蛹期有较高的表达量, 在中肠、马氏管、血淋巴、消化腺中有相对较高的表达量, 暗示其在斜纹夜蛾中存在重要的渗透压调节作用。本文结果为进一步研究水通道蛋白在斜纹夜蛾中的作用提供了一定的分子基础。     

盐胁迫对昆虫病原真菌环链棒束孢生长及基因表达的影响

环链棒束孢Isaria cateniannulata是一种重要的昆虫病原真菌,广泛应用于茶园害虫的防治。环境胁迫是影响该菌株生长、扩散和菌株毒力的不利外界因素,其中盐胁迫对环链棒束孢的生长和基因转录表达的影响尚不清楚。本研究采用0（对照）、0.6和1.0mol/L的NaCl处理菌株,观测不同浓度NaCl对菌株表型的生长抑制作用,并对3组处理做了转录组分析。结果表明,3组处理共拼接到37 833个转录本,得到10 441个unigenes。与对照组相比,0.6和1.0mol/L NaCl处理组共鉴定出1 074个和2 412个差异表达基因,其中697个和1 201个表达上升,377个和1 211个表达下降。这些差异表达基因分别参与了碳水化合物和氨基酸的代谢、核糖体的生物合成、脂肪酸的合成与降解。为了验证转录组结果的准确性,本研究进一步通过qRT-PCR技术验证了12个差异表达基因的表达谱,研究结果为进一步了解环链棒束孢抵抗盐胁迫的分子机理奠定了理论基础。     

环链棒束孢IcHsp104与IcHsp78的克隆及在不同胁迫条件下的表达检测

【背景】环链棒束孢(Isariacateinannulata)是一种重要的虫生真菌,许多环境因子的胁迫作用影响了该菌在田间的生防效果。【目的】热休克蛋白酪蛋白溶解蛋白酶(HeatShockProteinCasein LyticProteinase,Hsp100/Clp)是一类ATP依赖型Hsp100家族蛋白,克隆该菌株Hsp100/ClpB家族的2个关键基因IcHsp104与IcHsp78,探索该对基因在应对不同温度及盐浓度胁迫下的作用。【方法】通过前期获得的转录组数据库,采用本地BLAST方法对环链棒束孢Hsp100家族基因进行分析筛选。通过RT-PCR技术,对环链棒束孢Hsp100基因的编码区(Open Reading Frame,ORF)进行碱基验证。通过分子生物信息学分析软件,对环链棒束孢Hsp100基因的氨基酸结构、进化树、功能结构域和三级结构进行分析。通过不同温度及盐浓度处理菌株,采用荧光定量PCR(Real-TimeQuantitative PCR,RT-qPCR)技术,对获得的基因进行表达检测。【结果】共筛选出2个环链棒束孢Hsp100/ClpB基因Hsp104与Hsp78,将其命名为IcHsp104与IcHsp78,2个基因分别编码923个和805个氨基酸,分子量分别为103.199 kD和88.805 kD;2个基因均与棒束孢属、白僵菌属和虫草属3个物种的亲缘关系最近,但2个基因之间的同源性较低;2个基因编码的蛋白均为经典的AAA+-ATPase家族蛋白,三级结构以α螺旋为主。另外,经高低温处理菌株后,2个基因的表达均会上调,并随处理时间的延长上升越显著,而且高温胁迫组显著强于低温组。经不同浓度氯化钠处理后,低浓度组2个基因的表达量均上调,高浓度组2个基因的表达量均受到抑制。【结论】环链棒束孢IcHsp104与IcHsp78基因在抵抗外界温度及盐胁迫过程中起到重要的作用,为后续环链棒束孢应对环境胁迫的机理研究提供了理论基础。     

环链棒束孢hsp90基因的克隆及冷热胁迫下的表达特征分析

通过本地Blast筛选转录组数据库方法,首次克隆了环链棒束孢热休克蛋白90基因全长cDNA序列,命名为Ichsp90（GenBank登录号KT944289）。克隆结果表明,该序列含有2 284个碱基,包括一个含2 097个碱基的开放阅读框,编码699个氨基酸,推测蛋白的分子量为79.23kDa,等电点（pI）为4.86,且含有5个Hsp90家族特征基序和胞质特征序列MEEVD,推导的氨基酸序列与其他丝状真菌相似性在92%-96%之间。用qRT-PCR方法分析了冷热胁迫下,该基因在环链棒束孢中的相对表达情况,结果表明：在4℃冷胁迫下15min检测到Ichsp90表达量下降到最低点,为对照的-1.8倍;随后表达量开始上升,至120min表达量是对照的1.07倍。在39℃高温胁迫下,60min Ichsp90表达量达到最高峰,为对照样品的5.02倍;随后表达量开始下降,至110min为对照样品的2.46倍。因此推测,Ichsp90基因在环链棒束孢抵抗外界温度胁迫中发挥重要的作用。