中华蜜蜂肠粘蛋白AcMucin5AC-1的鉴定和定位分析

【目的】本研究旨在鉴定中华蜜蜂Apis cerana cerana肠粘蛋白AcMucin5AC-1的结构、分布及对中肠的影响,为解析蜜蜂中肠的生理功能提供理论依据。【方法】利用生物信息学比较分析中华蜜蜂AcMucin5AC蛋白的序列特征;利用RT-qPCR检测AcMucin5AC-1在中华蜜蜂4日龄幼虫中肠和表皮以及2日龄幼虫感染中华蜜蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus, CSBV)后0, 12, 24, 48和72 h时中肠中的表达量。通过原核表达系统对中华蜜蜂AcMucin5AC-1进行表达,亲和层析柱纯化重组蛋白并制备相应多克隆抗体;Western blot检测AcMucin5AC-1在中华蜜蜂健康3-6日龄幼虫中以及4日龄幼虫中肠、表皮和围食膜中的表达,应用间接免疫荧光试验分析AcMucin5AC-1在中华蜜蜂4日龄幼虫中的定位。通过饲喂法利用RNAi沉默中华蜜蜂2日龄幼虫AcMucin5AC-1后12, 24, 48和72 h时分析RNAi干扰效率,利用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色法探究RNAi干扰2日幼虫AcMuc...     

中华蜜蜂AcNPC2b的原核表达和鉴定

[目的]中华蜜蜂Apis cerana cerana(简称中蜂),其胞内胆固醇转运体AcNPC2a能够识别并结合几种微生物的细胞壁,AcNPC2存在于该蜂触角,参与嗅觉通讯,关于AcNPC2b的功能尚未见报道.[方法]通过对中华蜜蜂AcNPC2b基因进行原核表达,以纯化的重组蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗血清;利用荧光定量PCR和免疫印迹检测AcNPC2b的转录活性及蛋白水平,通过微生物结合测定对AcNPC2b的功能进行探索.[结果]中蜂AcNPC2b含有信号肽和ML结构域,具有3个二硫键,与果蝇Drosophila melanogaster DmNPC2b聚为一个亚枝.荧光定量qRT-PCR检测发现,感染中蜂囊状幼虫病毒(Chinses sacbrood virus,简称CSBV)的幼虫体内AcNPC2b基因的表达呈现出先微弱下调再持续上调的趋势.获得了约16ku的重组蛋白AcNPC2b并制备了多克隆抗体,免疫印迹结果表明,中蜂AcNPC2b蛋白在工蜂头、胸与中肠中的表达量最高,触角、马氏管与脂肪体中次之.AcNPC2b蛋白在正常与感染CSBV病毒的中蜂幼虫中均有表达,且在感染CSBV的中蜂幼虫中有微弱上调.重组蛋白AcNPC2b微生物结合测定实验结果显示中蜂AcNPC2b重组蛋白均能与活的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、芽孢杆菌以及白僵菌结合.[结论]正常与感染CSBV病毒的中蜂幼虫体内AcNPC2b基因转录水平和AcNPC2b蛋白的表达含量存在差异,重组蛋白AcNPC2b具有识别并结合病原菌的能力,为后续深入研究AcNPC2b蛋白的分子功能奠定了一定理论基础.     

hKCNQ1/hKCNQ2嵌合体的构建,表达及电生理学特性

目的:构建hKCNQ1/hKCNQ2嵌合体,研究嵌合体通道的电生理学特征,为分析PIP2对hKcnq1通道的调节机制打下基础.方法:利甩over-lapPCR方法构建hKCNQ1/hKCNQ2嵌合体质粒(Q1ctQ2-pCI、Q1ctQ2-pcDNA3.1),转染HEK293细胞,采用全细胞膜片钳技术记录HEK293细胞上嵌合体电流.结果:在全细胞膜片钳记录模式下,转染了嵌合体Q1ctQ2-pCI的HEK293细胞电流密度160为5.2±0.87 pA/pf,其半数激活电压V0.5为23.3±8.9 mV(n=6);转染了嵌合体Q2ctQ1-pcDNA3.1的HEK293细胞电流密度160为21.7±4.2 pA/pf,其半数激活电压V0.5为-37.5±3.6 mV(n=9).结论:成功构建了hKCNQ1/hKCNQ2嵌合体并完成了嵌合体重组质粒的异源性表达和膜片钳记录.     

中国棉铃虫核型多角体病毒VHA273原毒株及其克隆株的比较研究

本文从形态结构、生物活性、核酸限制性内切酶图谱、结构多肽等方面对中国棉铃虫核型多角体病毒(HaNPV)VHA_(273)多粒包埋型原毒株及其单粒包埋型克隆株H_9进行了比较研究。它们对中国棉铃虫三龄初幼虫的LC_(50)值分别为2.987×10~4 PIBs/mL和1.647×10~4 PIBs/mL;当感染剂量为2×10~7 PIBs/mL时,其LT_(50)值分别是4.866d和4.797d。两个毒株的生物活性差别不大。经SDS-PAGE分析,两毒株结构多肽图谱带型相差较大。两毒株基因组经EcoR Ⅰ,BamH Ⅰ,Hind Ⅲ和Xba Ⅰ消化后,得到的内切酶图谱表现为两毒株间有差别。这些差异的发现将有助于从分子水平揭示多粒包埋病毒和单粒包埋病毒形成原因。     

肌动蛋白在AcMNPV向细胞外运输过程中作用的初步研究

本实验利用AcMNPV(Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus,AcMNPV)的bac-to-bac系统构建了两种重组病毒,即含GFP-actin融合基因的重组病毒AcMNPV-GFP-actin和含GFP基因的重组病毒AcMNPV-GFP。用这两种重组病毒分别感染Sf9细胞,以AcMNPV-GFP感染的Sf9细胞为对照,用共聚焦激光扫描显微镜观察了绿色荧光在病毒感染过程中的分布情况。由于肌动蛋白和绿色荧光蛋白是共定位的,所以绿色荧光的分布情况就是肌动蛋白的分布情况。实验中观察发现,AcMNPV-GFP感染的Sf9细胞中的绿色荧光,在整个感染过程中是弥散分布的,而AcMNPV-GFP-actin感染Sf9细胞后24172h这段时间内,肌动蛋白最初聚集在细胞核内,随后逐渐由细胞核向细胞质转移,最后完全聚集于细胞膜。根据实验结果,推测肌动蛋白可能参与了AcMNPV出芽型病毒粒子(BV)由细胞核向细胞质运输以及从细胞膜排出的过程。     

中国棉铃虫核型多角体病毒VHA_(273)原毒株及其克隆株的比较研究

本文从形态结构、生物活性、核酸限制性内切酶图谱、结构多肽等方面对中国棉铃虫核型多角体病毒(HaNPV)VHA273多粒包埋型原毒株及其单粒包埋型克隆株H9进行了比较研究.它们对中国棉铃虫三龄初幼虫的LC5o值分别为2.987×104PIBs/mL和1.647×104PIBs/mL当感染剂量为2×107PIBs/mL时,其LT5o值分别是4.866d和4.797d.两个毒株的生物活性差别不大.经SDS-PAGE分析,两毒株结构多肽图谱带型相差较大.两毒株基因组经EcoR Ⅰ,BamH Ⅰ,Hind Ⅲ和Xba Ⅰ消化后,得到的内切酶图谱表现为两毒株间有差别.这些差异的发现将有助于从分子水平揭示多粒包埋病毒和单粒包埋病毒形成原因.     

基因治疗微链载体的构建及表达分析

基因载体的转染、表达效率低和存在安全问题是基因治疗的难点。由于传统病毒及质粒载体含有大量外源基因, 其表达有可能引发较严重免疫副反应。本课题旨在新的设计思路上开发高效安全基因治疗载体。 微链载体利用设计好的Cap序列封闭基因表达框两端, 起到防止细胞内核酸外切酶降解的作用。从pEGFP-N3质粒中分离纯化得到GFP基因作为微链载体的报告基因。将微链载体与原质粒载体(pEGFP-N3质粒)分别转染入真核细胞, 利用荧光显微镜和流式细胞仪检测并比较其转染效率。结果显示微链载体在293、CNE2、3T3、B95-8等真核细胞中的转染、表达效率较高, 并具有较小的细胞毒性。初步证实了微链载体在真核细胞中转染、表达效率及安全性等方面具有一定的优越性。     

人生长激素慢病毒载体的构建及其在鼠骨骼肌成肌细胞中的表达

构建能表达人生长激素(hGH)的pLentivirus6/V5-hGH载体,并实现hGH基因在骨骼肌成肌细胞中大量、长期和稳定的表达。体外培养SD鼠骨骼肌成肌细胞,并通过免疫组织化学方法鉴定所得细胞、用台酚兰染色确定培养细胞的活性并绘制生长曲线。将目的基因hGH亚克隆到真核细胞表达载体pLenti6/V5-D-TOPO载体上,构建重组质粒pLentivirus6/V5-hGH。将pLenti6/V5-hGH及阳性对照质粒pLenti6/V5-EGFP分别用Lipofectamin2000介导转染体外培养的SD乳鼠骨骼肌成肌细胞。在激光共聚焦扫描显微镜下计数,确定阳性对照质粒的转染数,从而估计该基因的转染效率。加入筛选试剂以获得稳定表达异源生长激素(GH)的成肌细胞。收集转染及筛选后的细胞培养基,用放射免疫分析法(RIA)检测重组人生长激素(rhGH)的表达水平。聚合酶链式反应法(PCR)及DNA测序显示hGH基因成功地插入到pLenti6/V5-D-TOPO载体中;阳性对照质粒转染细胞24h后,在激光共聚焦显微镜下观察,其转染效率达40%以上。检测收集的上清,与对照组相比,有极显著差异(P<0.01),观察至第8周,rhGH仍持续稳定表达。通过检测培养的chang-liver肝细胞上清中胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的水平,验证了rhGH的生物学活性。实验通过培养高纯度的成肌细胞,构建了能在真核细胞内表达hGH的重组质粒pLenti6/V5-hGH,实现了hGH基因在骨骼肌成肌细胞中大量、长期和稳定的表达,并且获得的rhGH具有较强的促进肝细胞分泌IGF-1的能力。     

肌动蛋白在AcMNPV向细胞外运输过程中作用的初步研究

本实验利用AcMNPV(Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus,AcMNPV)的bac-to-bac系统构建了两种重组病毒,即含GFP-actin融合基因的重组病毒AcMNPV-GFP-actin和含GFP基因的重组病毒AcMNPV-GFP.用这两种重组病毒分别感染Sf9细胞,以AcMNPV-GFP感染的Sf9细胞为对照,用共聚焦激光扫描显微镜观察了绿色荧光在病毒感染过程中的分布情况.由于肌动蛋白和绿色荧光蛋白是共定位的,所以绿色荧光的分布情况就是肌动蛋白的分布情况.实验中观察发现,AcMNPV-GFP感染的Sf9细胞中的绿色荧光,在整个感染过程中是弥散分布的,而AcMNPV-GFP-actin感染Sf9细胞后24-72h这段时间内,肌动蛋白最初聚集在细胞核内,随后逐渐由细胞核向细胞质转移,最后完全聚集于细胞膜.根据实验结果,推测肌动蛋白可能参与了AcMNPV出芽型病毒粒子(BV)由细胞核向细胞质运输以及从细胞膜排出的过程.