人尿激酶原cDNA在中国仓鼠卵巢细胞(CH0)中高效表达研究

通过构建高效表达载体,改进转染方法,与二氢叶酸还原酶(dhfr)基因共扩增等手段在CH0细胞内高效表达了人尿激酶原(Pr0-UK)cDNA。首先将pro—UK cDNA插入到sR α启动子的下游,构建成表达质粒pMGl0102,在cos－7细胞内进行暂时性表达,结果表明此启动子的表达水平比SV40早期启动子高约5倍。然后将质粒pMG10102和pSV2－dhfr线性化后用磅酸钙共沉淀法转染CH0－dhfr-细胞,经一系列筛选后获得20个能表达pro—UK的细胞克隆,纤维蛋白溶解平板法(FAPA)测定表达水平为12．5—100IU／10⁶cells／d．再经MTX加压共扩增,得到9株高表达细胞系,其中最高的表达水平达到400—500Iu／10‘cells／d。2—3个月连续传代,表达水平未下降,表明细胞株是稳定的。Western Blot分析证明细胞分泌的重组pro－UK具有与天然pro—UK相同的分子量,而且培养液中不加蛋白酶抑制剂时,分泌的重组UK大部分为单链(60％以上)。     

重组痘苗病毒表达乙肝核心抗原基因的研究

pMM2066质粒EcoR I酶切回收ATG前只有12bp的乙肝核心抗原基因片段,将此基因片段插入痘苗转移载体pGJP-5的P7．5启动子后,组建成P5-C2066质粒,通过细胞内同源重组技术,于BudR存在条件下用人TK-143细胞筛选出三株能表达HBcAg的重组痘苗病毒株。感染细胞上清液1：64稀释时仍能用ELISA法测到HBcAg活性,同时也能测到滴度相近的HBeAg活性。免疫电镜可见平均为26．6nm的HBcAg颗粒。进行了不同量的重组痘苗病毒感染不同细胞,和不同培养温度对HBcAg表达影响的观察。     

含不同长度前C序列的乙型肝炎病毒核心抗原基因在重组痘苗病毒中的表达

核酸序列分析表明,乙型肝炎(乙肝)病毒核心抗原基因(C基因)编码区内存在两个ATG。目前认为第二个ATG为乙肝病毒C抗原的起始密码子,两个ATG之间的序列称为前C序列,共87bp。Uy、Rutter、Roossinck及景新等的研究表明,含前C序列时,C基因在大肠杆菌中的表达是形成具有HBeAg活性的P25~e膜蛋白,在哺乳动物细胞中的表达则是形成分泌性的HBeAg;不含前C序列时,在大肠杆菌和哺乳动物细胞中均形成P21~e     

痘苗病毒不同启动子对乙型肝炎病毒表面抗原表达的影响

利用DNA重组和细胞体内同源重组技术,分别获得了P7.5启动子和P11启动子单独带动的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)基因的重组痘苗病毒和同一个重组痘苗病毒中含有P7.5和P11启动子分别带动一个HBsAg基因(正反两个插入方向)的四种重组痘苗病毒,比较了它们对HBsAg表达的影响。含P7.5启动子的比含P11启动子的重组痘苗病毒表达的HBsAg水平更高些;在同一个重组痘苗病毒中P7.5和P11两个启动子分别带动HBsAg基因时,两个启动子同向转录表达的HBsAg水平较低,而两个启动子又向转录时表达的HBsAg水平较高,但均没有单一P7.5启动子带动的HBsAg基因的表达水平高。     

不含信号肽序列人尿激酶原全长cDNA的克隆及在大肠杆菌中的表达

从pro—uK全长cDNA中切下包括信号肽序列的N端371bp片段,经Fnu4HI不完全酶切将信号肽序列去掉,回收304bp片段,该片段再与人工合成的含HindⅢ、EcoRV内切酶位点和起始密码ATG的寡核苷酸片段连接,转化得一重组质粒,该中间质粒经酶切和序列分析证明构建正确后再与pro—UK cDNA其余片段相连按,得到全长pro一UK cDNA。我们将所得不含信号肽序列的pro—UK cDNA重组到带有PRPL启动子的原核表达载体pHv220中,转化大肠杆菌JM101,42℃诱导6h,菌体超声破碎后其上清及不溶性成份均可测出尿激酶活性。用ELISA法检测尿激酶抗原性表现为强阳性;纤维蛋白溶解平板法(FAPA)测定活性可达500－1000IU／L,经复性活性可达60000lU／L,虽表达产物可被抗尿激酶血清特异中和,经相差显微镜及电镜观察均证明表达蛋白绝大部分以包涵体形式存在。Western blot分析证明表达产物为单链pro-UK,分子量约为47kDa,与国外文献报导一致。     

人尿激酶原全长cDNA在中国仓鼠卵巢细胞中的稳定表达

通过磷酸钙共沉淀技术,将含有尿激酶原cDNA的表达载体(pSV₂-PrUK)与含有二氢叶酸还原酶基因的表达质粒pSV2-dhfr-或MMTV—dhfr共转染中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶基因缺陷株(CHO-dhfr^-)。利用选择培养基选择出二氧叶酸还原酶基因表达阳性(dhfr⁺)的转化细胞灶。用溶解圈法测定尿激酶型纤溶酶原激活剂(u—PA)的生物活性,其中两株显著高于其他株细胞,命名为CLF-14和CLF-8,表达水平依次为24Iu／10⁶细胞／48h,16Iu／10⁶细胞／48h。用ELLSA测定CLF一14和cLF-8细胞上清,表现为强阳性,阳性值比阴性对照值(P／N)大于10,CLF-14和CLF-8细胞表达量分别为0．14-o．22μg／10⁶细胞／48h和0．08-O．14μg／10⁶细胞／48h。分泌产物能被抗尿激酶(UK)血清抑制,而不被抗组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)的抗血清和正常兔血清抑制。     

BHK_(21)C_(13)细胞的悬浮培养

本文报告BHK_(21)C_(13)细胞的悬浮培养研究。细胞经30天悬浮培养适应后能稳定生长。适应后细胞在所试的199和HL各半量、HTYs、HTYsh和HTYfs培基中都能连续稳定悬浮培养生长。适应后,细胞大小无明显变化;单层培养时生长速度加快;细胞染色体数目发生变化,文內对此作了讨论。     

人尿激酶基因克隆的分离

<正> 我们利用噬菌斑原位杂交的方法,从人的基因文库中钓出人尿激酶基因克隆,这对分析尿激酶的基因结构、研究其表达调控都是很有意义的。现将初步结果简报如下: 本研究所用基因文库(吴旻教授惠赠)系将人胎儿食管粘膜总DNA的随机片段,经Burn H I位点插入取代型噬菌体载体EMBL_3,经包装、转染Ecoli K802株而成,滴度为     

新型溶血栓剂——低分子量单链尿激酶

尿激酶是由人肾合成人尿释放的一种血纤溶酶原激活剂(Plasminogen Activator)。尿激酶以多种分子形式存在,主要有三种,一种是高分子量双链尿激酶,它的分子量为54000道尔顿,由A、B两条肽链组成,A、B二链由二硫键相连。     

新型溶血栓制剂研究——Bollen教授来院讲学内容介绍

1987年10月比利时布鲁塞尔大学应用遗传部主任Bollen A,教授来我院讲学,其中关于新型溶血栓制剂研究方面的内容比较新,在国际上也是比较领先的。笔者将其整理出来,供同行参改。 在清除血管中不溶性血纤蛋白方面血纤蛋白溶解系统起着主要的作用。它通过将无活性