CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶的表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的 将肺炎克雷伯菌所产CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamase,ESBLs)进行表达、纯化及其多克隆抗体的制备.方法 将保存的重组质粒pET-28a(+)/CTX-M-3在大肠埃希菌BL21( DE3)中原核表达.IPTG诱导CTX-M-3融合蛋白表达,利用镍琼脂糖凝胶亲和柱层析纯化蛋白,用纯化的CTX-M-3型ESBLs酶蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体.结果 可溶性检测表明表达产物以可溶性形式(上清中)和包涵体形式(沉淀中)两种形式存在.通过蛋白表达条件的优化实验,SDS-PAGE电泳结果显示18℃,0.8 mmol/L IPTG诱导24 h的CTX-M-3重组蛋白的可溶性表达最佳.SDS-PAGE电泳和Western-blot检测表明获得纯化的重组32 kD蛋白.免疫获得的CTX-M-3型ESBLs酶蛋白抗血清的效价为1∶32.结论 pET-28a(+)/CTX-M-3表达载体在大肠埃希菌BL21( DE3)中表达,用His亲和层析柱纯化可获得高纯度可溶性的重组蛋白,成功制备了效价较高的抗CTX-M-3型ESBLs酶蛋白多克隆抗体.     

CTX-M型阴沟肠杆菌插入序列的检测

目的研究插入序列ISEcp1B及超广谱β-内酰胺酶(extended spectrum beta-lactamase,ESBLs)、AmpC酶基因在CTX-M型阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae,ECL)中的分布,并分析其与耐药的关系。方法用MIC法分析2株含CTX-M基因的阴沟肠杆菌的耐药性;用多重聚合酶链反应(PCR)技术扩增ESBLs、AmpC、ISEcp1B基因及I类整合子,对PCR产物进行DNA测序。结果 2株阴沟肠杆菌对青霉素类、四代头孢菌素、喹诺酮类和呋喃类抗生素耐药,对氨基糖苷类和碳青霉烯类表现为敏感。在ECL15同时检出TEM、CTX-M-G1、ACT-1、I类整合子及ISEcp1B基因;在ECL45同时检出SHV、CTX-M-G1及ISEcp1B基因。ECL45(400 bp)ISEcp1B的右端均连接一个反向重复序列,有-35及-10两个启动子,与CTX-M型ESBLs编码起始距离不相同,与ECL15序列一致,GenBank登录号:EF437434;ECL45(500 bp)无反向重复序列,只有一个-35启动子,与CTX-M型ESBLs编码起始距离不相同,与ECL15序列不相同,GenBank登录号:EF441350。结论在CTX-M型阴沟肠杆菌中检出2种新的插入序列ISEcp1B,其对CTX-M的高水平表达和传播可能起重要的调控作用。     

铜绿假单胞菌外膜蛋白缺失合并qacE△12sul1与耐药性的研究

目的 对临床分离的54株铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PAE)进行耐药基因检测,分析的PAE耐药性,为临床合理用药提供依据.方法 应用MIC法和K-B法检测PAE对22种药物的耐药性,采用PCR法检测PAE的消毒剂磺胺类qacE△12sul1基因和外膜蛋白oprD2基因,并对阳性菌株进行序列分析.结果 54株PAE中oprD2膜缺失、qacE△12sul1、多重耐药铜绿假单胞菌(Multi-drug Resistant of Pseudomonas aeruginosa,MRPA)菌株的检出率分别为77.8％、14.8％、37.0％;20株MRPA菌株中,qacE△12sul1、oprD2膜缺失阳性率分别为40.0％、50.0％;54株PAE对氨苄西林和头孢唑啉完全耐药,对头孢呋辛钠、头孢呋辛酯、复方新诺明的耐药率均为98.1％、对多粘菌素B敏感率为100％;MRPA与非MRPA对qacE△12sul1基因阳性菌株的检出率差异有统计学意义;oprD2阴性和阳性菌株对亚胺培南和美洛培南的耐药率差异有统计学意义.结论 临床分离的铜绿假单胞菌耐药严重,oprD2基因的缺失可能是亚胺培南和美洛培南耐药的主要原因.     

CMY-39型AmpC酶新基因亚型的序列分析与原核表达

目的对弗劳地枸橼酸杆菌所产CMY-39型AmpC酶新基因亚型进行基因克隆和重组表达。方法以产CMY-39型AmpC酶新基因亚型的弗劳地枸橼酸杆菌总基因组DNA为模板,PCR扩增CMY-39,将其克隆入pGEM-T载体后测定该核苷酸序列,再将CMY-39基因克隆到pET-32 a（＋）系统进行重组,重组菌在大肠埃希菌BL21中表达,SDS-PAGE电泳鉴定酶蛋白的表达。结果 PCR扩增出大小为1 146 bp的基因片段,与GenBank上CMY-39的基因序列同源性为99%。大肠埃希菌BL21转化pET-32 a（＋）/CMY-39重组质粒后,AmpC酶三维试验为阳性。此基因能在大肠埃希菌中大量表达,SDS-PAGE电泳显示,蛋白分子质量大约为60 kD。结论此基因为CMY-39新基因亚型,登陆号为HM565135;成功表达重组的CMY-39型酶,为进一步做酶动力学及酶的其他分子生物学特性研究奠定了基础。     

ISEcp1B介导铜绿假单胞菌CTX—M型ESBLs传播的分子机制研究

目的了解CTX-M型超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）在铜绿假单胞菌传播的分子机制。方法用Kirby-Bauer（K-B）药敏法分析26株铜绿假单胞菌的耐药性;用多重聚合酶链式反应（PCR）扩增ESBLs、ISEcp1B插入序列及Ⅰ类整合子;用套式PCR在Ⅰ类整合子寻找β-内酰胺酶基因盒。结果26株多重耐药铜绿假单胞菌对下列抗生素的耐药率为：（1）头孢噻肟（69．23％）、哌拉西林（65．38％）、替卡西林／克拉维酸（65．38％）、头孢他啶（57．69％）、头孢吡肟（46．15％）、环丙沙星（50．00％）、氨曲南（46．15％）、阿米卡星（34．62％）、亚胺培南（30．77％）、头孢哌酮／舒巴坦（23．08％）;（2）11株铜绿假单胞菌中检出CTX-M-G1,其中4株同时检出TEM、SHV、CTX-M-G1、ISEcp1B及Ⅰ类整合子,Ⅰ类整合子内未扩增出β-内酰胺酶;（3）ISEcp1B下游均连接CTX-M型ESBLs,ISEcp1B右端有一个反向重复序列,为转位酶提供作用位点;-35及-10位点各有一个启动子,对下游不同的CTX-M型ESBLs的高水平表达和传播起重要的调控作用。结论ISEcp1B可能对下游CTX-M型ESBLs的高水平表达和传播起重要的调控作用。     

化学发光微粒子免疫法和梅毒螺旋体颗粒凝集试验检测梅毒抗体的比较

目的评价化学发光微粒子免疫法（chemiluminescence microparticle immunoassay, CMIA）检测临床血清标本梅毒螺旋体抗体的敏感性和特异性。方法用梅毒螺旋体颗粒凝集试验（TVeponema Pallidum particie agglutination test,TPPA）法作为对照标准,采用CMIA法检测2012年11月到12月1200例住院患者的血清标本,并用卡方检验评价两种检测方法对同一个样本的化验结果的一致性。结果1200例血清标本中用CMIA法检出阳性率为11.3%,TPPA法检出阳性率为10. 9% ,以TPPA为标准,CMIA法敏感性为96. 9%,特异性为99. 2%,其中CMIA法检测血清S/CO值〉 4. 00的110例,用TPPA确认107例阳性,阳性预测值（PPV）为97.3%;CMIA法S/C0值在1.0-9.0,TPPA可出现阴性结果。结论CMIA法可替代TPPA法进行梅毒螺旋体抗体检测,对于CMIA法检测S/C0值1. 0-4.0的需进一步复检。     

氨基糖苷类高水平耐药肠球菌耐药基因的检测与研究

目的 研究氨基糖苷类高水平耐药(high-level aminoglycoside-resistant,HLAR)肠球菌临床株表面蛋白基因(esp)、Ⅰ类整合酶基因(IntI1)、耐氯霉素肠球菌乙酰转移酶基因(cat)等三种耐药基因的流行情况及肠球菌对常见抗菌药物的耐药情况.方法 对53株肠球菌进行菌株鉴定和药敏试验,用PCR法扩增肠球菌esp基因、IntI1基因和cat基因,阳性产物送测序并对序列进行分析.结果 53株HLAR肠球菌中,esp基因阳性率为28.3％,Ⅰ类整合酶基因阳性率为49.1％,没有检测到cat基因.菌株对多种抗菌药物的耐药率为:氨苄西林62.3％、环丙沙星75.5％、红霉素94.3％、高水平庆大霉素75.5％、高水平链霉素73.6％、喹努普汀/达福普汀32.1％、四环素66.0％、万占霉素1.9％、利奈唑胺0.结论 肠球菌对常见抗菌药物存在不同程度的耐药,esp基因和IntI1基因与肠球菌耐药性密切相关.     

铜绿假单胞菌外膜蛋白缺失合并 qac E△12sul1与耐药性的研究

【摘 要】 目的 对临床分离的54株铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PAE)进行耐药基因检测,分析的PAE耐药性,为临床合理用药提供依据。 方法 应用MIC法和K-B法检测PAE对22种药物的耐药性,采用PCR法检测PAE的消毒剂磺胺类qac E△12 sul 1基因和外膜蛋白oprD2基因,并对阳性菌株进行序列分析。 结果 54株PAE中oprD2膜缺失、qac E△12 sul 1、多重耐药铜绿假单胞菌(Multi-drug Resistant of Pseudomonas aeruginosa,MRPA)菌株的检出率分别为77.8%、14.8%、37.0%;20株MRPA菌株中,qac E△12 sul 1、oprD2膜缺失阳性率分别为40.0%、50.0%;54株PAE对氨苄西林和头孢唑啉完全耐药,对头孢呋辛钠、头孢呋辛酯、复方新诺明的耐药率均为98.1%、对多粘菌素B敏感率为100%;MRPA与非MRPA对 qac E△12 sul 1基因阳性菌株的检出率差异有统计学意义;oprD2阴性和阳性菌株对亚胺培南和美洛培南的耐药率差异有统计学意义。 结论 临床分离的铜绿假单胞菌耐药严重,oprD 2基因的缺失可能是亚胺培南和美洛培南耐药的主要原因。     

儿童传染性单核细胞增多症淋巴细胞亚群的变化及意义

目的 通过对儿童传染性单核细胞增多症(infectious mononucleosis,IM)外周血淋巴细胞亚群的检测,探讨其细胞免疫功能变化与疾病的关系.方法 采用流式细胞仪对35例IM患儿外周血T、B和NK淋巴细胞亚群进行检测,30例健康儿童作为对照组;对患儿中的7例进行治疗2周后细胞亚群的测定以观察动态变化;对患儿进行外周血异型淋巴细胞计数.结果 IM患儿CD3、CD8 T淋巴细胞水平明显升高,CD19、NK、CD4和CD4/CD8值水平明显降低,分别与正常对照组比较差异均有统计学意义.7例IM患儿治疗2周后T细胞亚群的测定值与入院时比较差异有统计学意义,治疗前CD4、CD4/CD8值低于治疗后,治疗前CD8高于治疗后.IM患儿急性期CD8、CD4/CD8水平与患儿外周血异型淋巴细胞百分率(≤10％和＞10％)的差异有统计学意义.结论 检测淋巴细胞亚群对评估IM患儿的细胞免疫状况,辅助诊断和指导治疗具有重要的临床价值.