PRKAG2基因新突变体重组腺病毒载体的构建及其在心肌细胞中的表达

目的:构建携带人全长PRKAG2基因新突变体(PRKAG2 G100S)及增强型绿色荧光蛋白报告基因(EGFP)的重组腺病毒载体,并将其在乳鼠心肌细胞中表达.方法:利用Invitrogen的GatewayTM技术,通过重叠PCR技术将目的基因突变体PRKAG2G100S-IRES-EGFP及野生型PRKAG2-IRES-EGFP定向克隆至入门载体pDONR221上,然后与腺病毒载体pAd/CMV/V5-DEST重组反应,形成包含目的基因及EGFP的腺病毒表达克隆.经筛选阳性表达克隆并测序验证后,Pacl酶切、包装、扩增、纯化获得携带EGFP及PRKAG2基因的重组体腺病毒.病毒PCR鉴定并将其感染原代培养的SD乳鼠心肌细胞.用Western blot技术检测PRKAG2蛋白的表达.结果:成功构建了携带人PRKAG2 G100S及EGFP基因的重组腺病毒,病毒的滴度为8.4×108 pfu/ml.荧光显微镜下可见Ad-PRKAG2 G100S重组体腺病毒感染后的乳鼠心肌细胞表达EGFP而发出绿色荧光,PCR证实重组腺病毒载体构建成功,Western blot证明PRKAG2蛋白在乳鼠心肌细胞中过表达.结论:成功构建了携带EGFP基因的Ad-PRKAG2 G100S重组腺病毒载体并将其在乳鼠心肌细胞中正确表达,为今后突变体PRKAG2基因的功能研究奠定了基础.     

人PRKAG2全长基因的体外拼接及TA克隆载体的构建

目的:应用体外基因拼接及TA克隆技术构建含PRKAG2基因的载体.方法:通过商业途径购得PRKAG2基因的一个转录变体cDNA质粒(GenBank登记号BC 068598),其在N端缺失了44个氨基酸,根据已知的PRKAG2基因序列(GenBank登记号NM_016203),设计搭桥引物及序列扩增引物,通过PCR搭桥方法,合成完整全序列的PRKAG2基因,并将其克隆到TA载体,将得到的阳性克隆测序鉴定.结果:拼接出全长1759bp的PRKAG2基因,目的基因连接到载体后测序与设计的PRKAG2基因完全一致.结论:成功的构建了全长人PRKAG2基因的TA克隆,为进一步研究PRKAG2基因的功能提供了模板.     

斑马鱼心肌特异性启动子的克隆及其功能鉴定*

目的:探讨心室肌球蛋白重链(vmhc)基因启动子的心肌组织特异性.方法:利用PCR技术从斑马鱼基因组中克隆了vmhc编码区5’上游大小为1952bp的调控区域,应用酶切连接方法将vmhc启动子插入pGEFP-N1质粒,成功构建pEGFP-vmhc重组载体.再应用高保真DNA聚合酶PCR扩增包含vmhc启动子序列,增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因序列及3'UTR序列的基因片段,经过纯化后通过显微注射将vmhc-EGFP基因片段导入斑马鱼受精卵中.结果:注射后的斑马鱼心脏中出现绿色荧光,而其他部位无荧光出现.结论:vmhc启动子能够正确有效地驱动外源基因在斑马鱼心脏中特异表达,适合应用于心血管疾病的基因功能研究,基因靶向治疗等.