伤寒沙门菌非编码RNA617的分子鉴定及其对生物膜形成的影响研究

本研究旨在探讨伤寒沙门菌(Salmonella enterica serovar Typhi, S. Typhi)中非编码RNA617(non-coding RNA617,ncRNA617)的分子特性,并研究其对生物膜形成的影响及作用机制。采用Northern blot方法检测ncRNA617的表达,通过cDNA 5’末端快速扩增技术(5’-rapid amplification of cDNA end,5’RACE)和逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcriotion-polymerase chain reaction,3’RT-PCR)实验分析ncRNA617可能的转录起始位点和终止位点;构建ncRNA617缺陷菌株、回补菌株和过表达菌株等相关菌株,通过生物膜形成实验,观察ncRNA617对伤寒沙门菌生物膜形成的影响,并用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)分析生物膜形成相关基因表达水平的变化,综合运用生物信息学方法预测ncRNA617和差异基因的结合区域,初步分析ncRNA617发挥调控作用的机制。结果显示,伤寒沙门菌确有ncRNA617的表达,长度约300 nt,其转录起始位点位于mig-14终止密码子下游967 nt处,终止位点位于t2681起始密码子上游 2 378～2 560 nt处。与野生对照菌株相比,ncRNA617缺陷菌株生物膜形成能力增强(P<0.05),回补菌株的生物膜形成能力恢复至野生菌株水平,过表达菌株的生物膜形成能力有所下降(P<0.05)。qPCR结果表明,ncRNA617可负向调控多个生物膜形成相关基因的转录表达水平(P<0.05)。经生物信息学方法预测发现,ncRNA617与差异基因有不同的结合区域。本研究结果提示,ncRNA617在伤寒沙门菌中存在,其长度约270～452 nt。ncRNA617可能通过靶向结合生物膜形成相关基因下调基因表达,从而负向调控伤寒沙门菌生物膜的生成。     

腺苷酸激酶与AMP信号在感知及维持机体能量中的作用

腺苷酸激酶（AK）是催化各种腺嘌呤核苷酸相互转化的一种磷酸转移酶,其在维持细胞能量平衡中起着重要的作用。AK有七种亚型,在线粒体、胞浆、细胞核之间的能量转移和分布中起着至关重要的作用。细胞内、细胞外和血液中的AMP水平是机体能量感知、睡眠、冬眠和食物摄取的代谢信号。高于或低于正常水平的AMP信号与人类疾病相关。AK及其下游的AMP信号组成了一个完整的代谢监测系统,通过检测细胞能量状态变化,从而调整对代谢感受器传递的信号。详细阐述了AK和AMP在感知及维持机体能量中的作用。     

β-葡萄糖苷酶新型高产菌株筛选及其液态发酵培养基的优化

从腐败的玉米秸秆上分离得到一株能够发酵生产β-葡萄糖苷酶的弯颈霉属的柱孢弯颈霉菌株syzx4, 使用统计学方法对其发酵培养基进行优化。在单因子实验的基础上使用Plackett-Burman法对碳源、氮源和无机盐进行产酶显著性分析, 培养基组分对β-葡萄糖苷酶生产影响的排序为: 气爆秸秆粉(TCS)>KH2PO4>黄豆饼粉(SM)=(NH4)2SO4。响应面模型结果表明最优培养基为: TCS 25.72 g/L, SM 6.82 g/L, KH2PO4 1.90 g/L, (NH4)2SO4 3.21 g/L, 其余成分保持原始浓度。在30 °C发酵8 d, β-葡萄糖苷酶的活性可以达到2.21 U/mL。     

海洋真菌灰绿曲霉地标蛋白编码基因AgTeaA的克隆与序列分析

为考察灰绿曲霉中地标蛋白AgTeaA对菌丝极化生长的作用,首先需要获得AgTeaA基因序列的相关信息.通过简并PCR的方法得到AgTeaA基因编码区的一段序列,以已知序列为基础通过染色体步移的方法获得基因全长及两端侧翼序列,然后通过逆转录PCR的方法确定出氨基酸序列,并利用相关生物学软件进行蛋白结构域的分析和系统进化树的构建.结果显示,AgTeaA基因编码区全长4 706 bp,对应氨基酸全长为l 477 aa,在256-320 bp,733-780bp,1 064-1 150 bp处各有一个内含子.与粟酒裂殖酵母Teal蛋白和构巢曲霉TeaA蛋白相似的是,AgTeaA在290-339aa,340-390 aa处各有一个Kelch结构域,在818-899aa,938-999aa,1 021-1 116aa,1 183-1 335aa处各有一个卷曲螺旋(coiled coil)结构域.     

天麻种子与真菌共生萌发的蛋白组学研究

天麻Gastrodia elata是典型的腐生型兰科药用植物,其种子萌发需要小菇属Mycena真菌的侵染和共生,目前天麻种子共生萌发分子机制是该领域的热点问题。我们首次对天麻种子共生萌发过程进行了系统的蛋白质组学研究。采用iTRAQ标记的液质联用技术,成功鉴定了天麻成熟种子和萌发后原球茎的蛋白质组,共鉴定蛋白1 769个（global FDR 1%）。两组进行了差异蛋白质组学研究,获得差异蛋白269个。差异蛋白GO注释结果表明,在天麻种子共生萌发过程中,差异蛋白参与的功能和生物过程多样,以催化和结合为主,还参与感知环境刺激、分子信号等功能。KEGG代谢通路分析表明,差异蛋白还主要参与了转导、能量代谢、次生代谢和环境适应等过程。我们发现,一些参与内吞作用的蛋白在共生萌发过程中存在差异表达,表明内吞可能参与到二者互作过程中。对差异蛋白质组的深入解析和研究有利于揭示天麻种子共生萌发的分子机制,具有较强的理论和现实意义。     

伤寒沙门菌Ⅵ型分泌系统对SopE表达影响的初步研究

为探索伤寒沙门菌Ⅵ型分泌系统(type 6 secretion system, T6SS)对SopE表达的影响,阐明其中的分子机制,本研究利用自杀质粒同源重组法构建携带sopE∷3×Flag的伤寒沙门菌野生株(WT-pBAD33)、T6SS功能分子缺陷株(ΔsciG-pBAD33)和回补株(C-ΔsciG),用构建成功的菌株感染巨噬细胞THP-1并在模拟巨噬细胞内环境(LPM培养基、微需氧)下培养,通过实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction, qRT-PCR)与蛋白质印迹法(Western blot, WB)试验探索T6SS对SopE表达的影响,采用β-半乳糖苷酶活性检测来进一步验证sopE基因启动子的转录水平,Ni柱纯化T6SS功能蛋白SciG,电泳迁移率变动分析(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)研究SciG蛋白对sopE基因启动子的调控作用。结果显示：ΔsciG-pBAD33中SopE表达水平较于WT-pBAD33明显降...     

海洋真菌灰绿曲霉蓝光感应基因Agwc1的克隆、鉴定与序列分析

蓝光感应系统在不同的光感应过程中都起到十分关键的作用,这些生理过程包括无性/有性发育,昼夜节律钟,次级代谢产物的生成等.为了对蓝光感应系统作进一步的研究,通过简并引物PCR 和基因组走读方法得到了海洋真菌灰绿曲霉蓝光调节受体基因Agwc1,并通过多种生物信息学方法对其核苷酸和蛋白质序列进行了分析.Agwc1 基因全长2 724 bp,包含3个内含子,编码852 个氨基酸,蛋白质分子量是96 kD,等电点为8.17,很有可能定位于细胞核中,通过序列比对与系统进化树分析,发现AgWC1 蛋白与其他物种中的WC-1 蛋白有很高的同源性.在本研究中成功鉴定了Agwc1 基因,这是国际上首次在海洋丝状真菌领域鉴定光感应基因,并且AgWC1 很有可能在灰绿曲霉蓝光感应系统中发挥重要功能.     

嗜酸乳杆菌LA-G80的毒理学研究

目的对嗜酸乳杆菌的毒性进行研究。方法采用大、小鼠急性毒性试验、Ames试验、小鼠骨髓细胞微核试验、小鼠精子畸形试验和大鼠30 d喂养等对嗜酸乳杆菌进行安全性试验研究。结果急性经口毒性试验表明,大、小鼠灌胃给予嗜酸乳杆菌,最大耐受剂量雌雄两性别均大于20.0 g/kg体重,Ames试验、微核试验和精子畸形试验结果均为阴性。大鼠30 d喂养试验结果表明各项指标均未见明显毒性反应。结论在本次实验条件下,嗜酸乳杆菌未见遗传毒性。由此可初步判定,使用嗜酸乳杆菌是安全可靠的。     

卡伍尔氏链霉菌NA4突变株〖WTHX〗ΔbafAI的次级代谢产物研究

链霉菌产生的次级代谢产物是农用和医药抗生素的重要来源。为了更深入挖掘卡伍尔氏链霉菌NA4潜在多样的次级代谢产物,对阻断NA4主产物bafilomycins的突变株ΔbafAI随机激活的代谢产物进行分离和鉴定。采用HP20固相萃取、硅胶柱色谱、凝胶柱色谱以及半制备HPLC等方法对ΔbafAI代谢产物进行分离纯化;使用NMR和MS确定化合物结构,并对单体化合物进行了生物活性测定。共分离鉴定6个化合物：环（L-异亮氨酸-L-脯氨酸）（1）、环（L-缬氨酸-L-脯氨酸）（2）、环（L-脯氨酸-L-亮氨酸）（3）、环（L-脯氨酸-L-苯丙氨酸）（4）、（2E, 4E）-5-（3-羟苯基）-戊-2, 4-二烯酰胺（5）和5′-脱氧-5′-甲硫肌苷（6）。6个化合物均是阻断NA4主产物后非特异激活的或产量显著提高的化合物,均为该菌中首次分离;化合物5和6是第二次从天然提取物中分离得到;化合物1和2显示出抗白色念珠菌活性,并首次报道了化合物5的抗氧化活性。进一步丰富了卡伍尔氏链霉菌NA4次级代谢产物研究,为激活沉默或低表达次级代谢产物合成基因簇提供了有益借鉴。