含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase-1)对猪伪狂犬病毒复制的影响

猪伪狂犬病是伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)感染引起的一种烈性接触性传染病,其感染宿主会触发机体先天免疫应答,引起I型干扰素(Type I interferon,IFN-1)和炎性细胞因子等细胞因子的产生,为研究可诱导产生炎性细胞因子的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cysteinyl aspartate specific proteinase 1,caspase-1)的基因敲除对PRV复制的影响,本试验利用近年来发展迅速的一项规律性短重复回文序列簇/Cas9核酸酶(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeat/CRISPR associated system 9,CRISPR/Cas9)基因定点修饰技术构建猪肾上皮细胞(Porcine kidney epithelial cells,PK15)caspase-1基因稳定敲除细胞系,并通过T7核酸酶检测敲除效率;细胞毒性(Cell counting kit-8,CCK-8)试剂盒检测PK15敲除caspase-1增殖影响;采用流式细胞术检测PRV-GFP感染PK15以及PK15-caspase-1^-/-的增殖差异;实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-PCR)检测PRV-gB、TK及白细胞介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)、IFN-β、干扰素刺激基因(Interferon-stimulated genes 20,ISG20)mRNA的表达;Western Blot检测PRV-gB蛋白表达;滴度测定检测子代病毒滴度。结果表明,2对特异性单链引导RNA(Single guide RNA,sgRNA)均能对caspase-1进行基因编辑,但经T7核酸酶酶切进行基因编辑效率分析结果表明sgRNA2的基因编辑效率较高;CCK-8试剂盒检测细胞活力结果表明caspase-1基因敲除对PK15以及PK15-caspase-1^-/-细胞活力无影响(P>0.05);流式细胞仪检测结果表明PRV-GFP在PK15-caspase-1^-/-中的增殖显著低于PK15细胞(P<0.05);定量RT-PCR结果表明PRV-gB、TK基因在PK15-caspase-1^-/-的mRNA表达显著低于PK15细胞(gB:P<0.05,TK:P<0.05),而IFN-β、ISG20基因在PK15-caspase-1^-/-的mRNA表达显著高于PK15细胞(gB:P<0.05,TK:P<0.05);Western Blot结果表明,PRV的gB蛋白在PK15-caspase-1^-/-的表达显著低于PK15细胞(P<0.05);滴度测定结果表明,敲除caspase-1能够抑制PRV子代病毒的增殖。以上结果均表明caspase-1基因敲除可抑制PRV在PK15细胞中复制。     

低温处理对侧耳属栽培菌株菌丝体酯酶同工酶谱的影响

应用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳对不同低温、不同缓化方式处理后的侧耳属(Pleurotus)不同栽培种12个菌株进行酯酶(EST)同工酶谱分析。结果表明:不同菌株对低温的耐受能力不同,缓化方式对于酯酶基因表达的影响不同,但低温并没有使其酯酶酶活力完全丧失。     

系统发育谱构建方法研究

随着后基因组时代的到来,系统发育谱方法作为一种非同源性的功能注释方法,已经被成功的应用到基因组功能预测、蛋白质相互作用预测等一些重要领域的研究中去。本文阐述了系统发育谱法的基本原理,详细地介绍了现有的几种系统发育谱的构建方法,并提出了利用ortholog来构建基因的系统发育谱的思想。     

五大连池火山区露头泉中细菌和古菌对扰动的响应

[目的]探析五大连池火山区露头泉细菌和古菌的群落结构及其对扰动的响应。[方法]采集五大连池露头泉水样,按扰动程度将其分为农田组(A1,A2,A3)、村屯组(B1,B2,B3)、景区组(C1,C2,C3)和野外组(D1,D2,D3),利用高通量测序技术对各组别露头泉中细菌和古菌的群落结构进行测序分析。[结果]各露头泉之间菌群多样性存在显著差异,野外组露头泉的细菌和古菌多样性及其丰富度较高;露头泉微生物各物种互作关系网络复杂,但多以Proteobacteria、Actinobacteria和Bacteroidetes等为优势细菌门,以Parvarchaeota、Woesearchaeota和Verrucomicrobia等为优势古菌门;在不同程度的扰动影响下,某些露头泉出现了特异优势菌,如Helicobacteraceae、Verrucomicrobiaceae和Deferribacteres等。[结论]五大连池火山区露头泉分布着丰富的细菌和古菌,人为活动产生的不同程度扰动,导致露头泉中细菌和古菌的多样性、组成及丰度呈现差异化。     

扎伊尔埃博拉病毒糖蛋白基因的克隆和表达

埃博拉病毒属丝状病毒科,能引发动物和人出血热症状,人感染后病死率高达90%以上,目前还没有有效预防和治疗的药物和疫苗。近年来,这种烈性传染病病毒传入我国的可能性不断加大,给我国公共卫生应急体系带来新的挑战。本研究针对埃博拉病毒的最主要结构蛋白——糖蛋白(GP),构建了重组原核表达载体pET28a(+)-GP1(33~313aa)、pET28a(+)-GP1(190~313aa)、pET28a(+)-GP2(502~632aa)、pET28a(+)-sGP,以及重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-edited GP、pcDNA3.1(+)-GP1、pcDNA3.1(+)-GP。结果表明,GP1(33~313aa)、GP1(190~313aa)和sGP能在大肠埃希菌BL21(DE3)中以包涵体的形式表达,GP、GP1和GP2能在HEK293T细胞中表达,但均不能在BHK21细胞中表达。本研究为进一步探索埃博拉病毒GP的结构和功能及GP抗体制备奠定了基础。     

H9N2亚型流感病毒核酸参考品研制及荧光RT-PCR检测验证

从H9N2亚型流感病毒A/chicken/Hunan/04.14 (H9N2)核酸中扩增了HA基因的编码序列,克隆测序后,采用体外转录方法制备RNA。用RNA保存液稀释至含量约10~9 copies/μL。分装后进行均匀性和稳定性检验,通过4家实验室协作标定,取平均值作为定值结果。此外,文中建立的实时荧光定量PCR (qPCR)快速检测技术,对临床样品进行准确检测验证,检测限可达10个拷贝。结果表明,文中制备的核酸参考品可作为H9N2亚型流感病毒核酸快速检测方法的阳性定量参考品。     

响应面法优化Fe~(2+)的微生物氧化条件

氧化亚铁钩端螺旋菌(Leptospirillum ferrooxidans,L.f)是一种极端嗜酸,专性自养氧化铁的细菌,能够耐受较低pH和较高的温度,被广泛应用于生物浸矿和环境治理。氧化亚铁钩端螺旋体菌的生物浸矿效率与其对Fe~(2+)氧化速率相关,因此,本文采用响应面法,通过建立二次多项式回归方程考察pH、温度、Fe~(2+)浓度及转速四个培养因素对Fe~(2+)氧化速率的影响。结果显示在pH为2.25、温度为32℃、初始Fe~(2+)浓度为175.36 mmol/L、转数为165 r/min时,Fe~(2+)最高氧化速率为0.2911 g/Lh。     

CYP9A17v2组成型过量表达参与棉铃虫对拟除虫菊酯的抗性

微粒体细胞色素P450氧化酶介导的解毒代谢增强是棉铃虫Helicoverpa armigera对拟除虫菊酯类杀虫剂产生抗性的主要原因。作者前期的研究表明, CYP9A12和CYP9A14组成型过量表达与棉铃虫YGF品系对拟除虫菊酯的高水平抗性相关, CYP9A12和CYP9A14的功能表达研究结果为其参与对拟除虫菊酯抗性提供了直接证据。本研究通过对棉铃虫CYP9A17v2的克隆、mRNA表达水平和功能表达的研究, 以期明确该基因是否参与棉铃虫对拟除虫菊酯的抗性。结果表明: CYP9A17v2与CYP9A12的氨基酸序列具有很高的相似性（94%）。与棉铃虫对照品系（YG）相比, CYP9A17v2在YGF抗性品系末龄幼虫脂肪体中具有10.9倍的组成型过量表达, 而在中肠中未发现过量表达。用酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae异源表达的CYP9A17v2能够代谢多种拟除虫菊酯（顺式氰戊菊酯、溴氰菊酯和氟氯氰菊酯）。据此认为CYP9A17v2组成型过量表达参与了棉铃虫对拟除虫菊酯的抗性。至此, CYP9A亚家族中已有3个P450基因（CYP9A12, CYP9A14 和 CYP9A17v2）被证实参与了棉铃虫对拟除虫菊酯的氧化解毒代谢。     

Z曲线在基因组中应用的研究与展望

随着后基因组时代的到来,大规模分子数据的处理和分析的需求变得越来越重要,生物数据的处理方法也层出不穷。这里介绍了一种新的表示DNA序列的模型-Z曲线,并详细的介绍了它的数学原理、和它在识别基因、基因起始位点以及识别Isochore结构上的应用,最后展望了Z曲线在识别TFBS上的应用。     

临床分离的表皮葡萄球菌产膜株检出方法及耐药性比较

目的对临床分离表皮葡萄球菌产膜株的检出方法及耐药性进行比较。方法采用刚果红培养基检出PIA阳性株;结晶紫染色进行生物膜定量测定;WalKAway-40全自动微生物鉴定仪检测表皮葡萄球菌临床株对17种抗菌药物耐药性。结果定量测定法及刚果红培养基I、II、III检出产膜株分别为16、10、8和12株;产膜与不产膜的表皮葡萄球菌对17种抗菌药物的耐药性差异无统计学意义(P0.05)。结论定量测定法及添加少量葡萄糖、氯化钠的刚果红培养基均能较好检出产膜菌;在浮游状态下产膜和不产膜表皮葡萄球菌对抗菌药物的耐药性差异无统计学意义。