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MutS蛋白是DNA错配修复系统的关键成份,其突变会使细胞失去正常的错配修复功能,导致基因组不稳定和细胞异常.本研究利用易错PCR随机突变和利福平筛选,建立了研究MutS蛋白的新方法,发现影响MutS错配修复功能的新位点,并利用表面等离子共振、分子筛、farwestern等方法对错配修复功能缺陷的突变体进行了活性测定和分析;通过揭示MutS与错配修复功能相关的新信息,为MutS同源物多态性的研究及人源MutS同源物突变与癌症相关的研究提供新的线索. 相似文献
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DNA错配修复蛋白MutS和MutL的相互作用研究 总被引:2,自引:0,他引:2
MutL 和 MutS 是DNA错配修复系统中起关键作用的修复蛋白. 利用基因融合技术高效表达了MutL 和 MutS融合蛋白,并利用它们发展了一种研究二者相互作用的简便方法. 融合蛋白MutL-GFP (Trx-His6-GFP-(Ser-Gly)6-MutL),MutL-Strep tagⅡ (Trx-His6-(Ser-Gly)6-Strep tagⅡ-(Ser-Gly)6-MutL) 和 MutS (Trx-His6-(Ser-Gly)6-MutS) 被构建并在大肠杆菌中高效表达. 收集菌体细胞、超声波破碎后离心取上清进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 分析,结果表明有与预期分子质量相应的诱导表达条带出现,其表达量约占全细胞蛋白的30%且以可溶形式存在. 利用固定化金属离子配体亲和层析柱分别纯化融合蛋白,其纯度达到90%. 通过将MutS蛋白固定的方法研究两种MutL融合蛋白分别与MutS之间的相互作用. 结果表明:只有MutS蛋白与含有错配碱基DNA分子结合后才与MutL蛋白发生相互作用. 通过检测MutL融合蛋白标记的绿色荧光信号或酶学显色信号来鉴定相互作用的发生. 建立的融合分子系统方法也为研究其他的蛋白质或生物大分子之间的相互作用提供了一个技术平台. 相似文献
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测蔗糖复合酶电极的研究 总被引:1,自引:1,他引:1
采用酶电极流动注射分析系统(EFIA),由固定化酶膜包括蔗糖转化酶(INV),葡萄糖变旋酶(MuT)及葡萄糖氧化酶(GOD)与氧电极共同组成的复合酶电极用于蔗糖的快速测定。实验确定每张酶膜的最适酶量(Iu比)为lNV:MUT:GOD:72:48:2.4。酶经固定化后,INV与MUT的综合回收活力>42.9%。其最适pH为5.8—6.5。最适温度范围是35—45℃。动态法和稳态法测试的线性范围分别为:5×10-4—10-1和10-5—2×10-3mol/L,响应时间分别<20s和<2 min。实验的重复性良好,变异系数<1.7%。用此酶电极测定以蔗糖为碳源的发酵液中的蔗糖含量,平均回收率达到98%。发酵液中的蔗糖分解产生的葡萄糖对本电极的干扰可通过平行运行的GOD电极来校正。连续使用的寿命至少为120h。比前年报道的14th有了显著的提高。酶膜显示了较好的保存稳定性(30天,保存于4℃蒸馏水中)和一定的抗热性(50℃,30min)。 相似文献
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结核分枝杆菌(Mycobaterium tuberculosis)是结核病的病原菌,每年导致数百万人死亡.对于分枝杆菌基本生物学特性的研究有助于新的药物及治疗手段的研发.耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)是分枝杆菌属中的一种非致病菌,与结核分枝杆菌亲缘关系较近,是实验室常用的研究分枝杆菌的模式菌种.分枝杆菌主要编码三种染色质蛋白,类组蛋白HU、Lsr2和宿主整合因子IHF.为研究IHF在染色体包装中的作用,我们在大肠杆菌中表达、纯化了耻垢分枝杆菌IHF蛋白(MsIHF),并对其影响DNA拓扑结构的性质进行了系统分析.体外研究的结果表明,MsIHF以同二聚体的形式存在,其对负超螺旋DNA具有一定的结合偏好性,同时,该蛋白可以有效地固定DNA负超螺旋.进一步的研究表明,MsIHF可以调控拓扑异构酶的活性.MsIHF的结合明显地抑制拓扑异构酶Ⅰ的松弛活性,而与此相反,该蛋白可以轻微地促进旋转酶引入DNA负超螺旋的能力.以上结果提示,MsIHF可能通过调控拓扑异构酶的活性影响染色体DNA的结构,进而调控其包装. 相似文献
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将酶电极应用于发酵糖的测定时。与糖共存的乙醇常常会影响测糖的准确性,通过对葡萄糖氧化酶(GOD)电极的研究,探讨了乙醇对测糖酶电极测定影响,进而研制出抗干扰的GOD酶电极,若是GOD电极的酶膜通过夹心法制备.在乙醇含量为0.1%(V/V)时·即产生显著的影响,使测定结果偏大4.3%,且乙醇的影响随浓度的升高而增大,若用尼龙网固定GOD膜,GOD电极在测定20mmol/L和5mm01/L左右的葡萄糖溶液时,含量高达9%的乙醇仍未对测定产生显著的影响.表现出良好的不受乙醇干扰的特性,并且,该尼龙网GOD电极具有良好的重复性、稳定的响应活性及较长的保存期. 相似文献
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体外分子定向进化研究进展 总被引:17,自引:2,他引:17
体外定向进化作为近几年发展起来的一种蛋白质改造新策略,可以在未知目标蛋白三维结构信息和作用机制的情况下,通过对编码基因的随机突变、重组和定向筛选,获得具有改进功能或全新功能的蛋白质,使几百万年的自然进化过程在短期内得以实现,因而是发现新的生物活性分子和反应途径的重要方法,已在短短几年内取得了令人瞩目的成就. 相似文献