叶酸缺乏对小鼠胚胎干细胞Nespas DMR区甲基化修饰的影响

目的：探讨叶酸缺乏对小鼠胚胎干细胞（ESCs）中Nespas差异甲基化区域（Differentially Methylated Region,DMR）甲基化修饰的影响以及叶酸浓度与甲基化水平的关系。方法：多种不同浓度叶酸处理小鼠ESCs,化学发光免疫分析法检测ESCs细胞内叶酸浓度。利用MassARRAY技术平台检测三种不同叶酸浓度处理后的ESCs中Nespas DMR启动子区,外显子区和内含子区甲基化修饰状态,并且分析Nespas DMR启动子区,外显子区和内含子区甲基化水平与叶酸浓度之间的关系。结果：无叶酸组（FF）小鼠ESCs细胞内叶酸浓度显著低于低叶酸组（FD）与正常叶酸组（FN）（P〈0.05）。Nespas DMR中启动子区、外显子区以及内含子区甲基化水平在FF组显著低于FD和FN组（P〈0.05）,并且Nespas DMR中启动子区以及内含子区甲基化水平与叶酸浓度存在显著的正相关（P〈0.05）。结论：叶酸缺乏影响小鼠ESCs中Nespas DMR区甲基化修饰的建立。     

组织叶酸检测方法的建立及应用

目的:采用目前常用的化学发光法检测组织叶酸,探索不同叶酸前处理,寻求合适的检测组织叶酸的实验方法。并将优化好的方法应用于叶酸缺乏小鼠模型的检测。方法:通过化学发光法检测组织叶酸含量,首先将一定量的组织放入合适的buffer中,匀浆器匀浆后,通过超声或煮沸处理样本,离心后,得到上清样本,建立标曲和质控后,进行上机测定。该方法中我们通过探讨不同的buffer(包括PBS、Lysis和Tris-base盐溶液)处理组织叶酸,和不同的处理条件(包括是否煮沸及煮沸时间、样本处理时间等),探讨该方法检测组织叶酸最优化条件;并应用该方法进行小鼠叶酸缺乏模型中各组织叶酸含量的检测。结果:我们选择雄鼠肝组织进行叶酸检测,分别用PBS、Lysis和Tris-base盐溶液进行样本前处理,结果发现同样的处理条件下,如不煮沸条件下,Tris-base盐溶液(38.72 ng/mg)PBS(15.68 ng/mg)Lysis(11.9 ng/mg),提示Tris-base盐溶液可能有助于叶酸的稳定,防止降解。同时,我们探讨煮沸对叶酸检测结果的影响,结果发现同一种前处理下(如Tris-base),不煮沸(38.72 ng/mg)煮沸1分钟(36.36 ng/mg)煮沸3分钟(33.28 ng/mg)煮沸5分钟(30.72 ng/mg),说明叶酸含量随着煮沸时间的延长逐渐降低。此外,我们还对叶酸检测结果的重复性和稳定性进行了评估,结果发现不煮沸条件下,叶酸结果重复性很好,但随着时间延长稳定性会逐渐下降。因此,我们选择了Tris-base盐溶液进行前处理,条件选择为不煮沸和立即检测来减少因样本处理问题产生的误差。我们用该方法检测了叶酸缺乏小鼠模型的各组织叶酸含量,结果发现肝组织18.81 ng/mg降为8.46 ng/mg,脑组织从0.37 ng/mg下降为0.19 ng/mg,脾脏组织从1.53 ng/mg下降为0.26 ng/mg,肺组织从0.47 ng/mg下降为0.13 ng/mg,肾脏组织从2 ng/mg下降为0.9 ng/mg,心脏组织从0.33 ng/mg下降为0.06 ng/mg说明饮食叶酸是体内叶酸的主要来源,其缺乏可能导致多种组织叶酸代谢异常。结论:组织叶酸化学发光法检测条件优化为Tris-base盐溶液进行前处理,条件选择为不煮沸,并将样本立即进行检测。我们用该方法检测小鼠叶酸缺乏模型发现低叶酸饮食能显著降低各组织的叶酸含量,可能对生长发育造成潜在的影响。