小鼠受精卵微注射Cdc25b mRNA可提高卵裂率并促进受精卵发育

为了观察Cdc25B蛋白及PKA/Cdc25B 信号途径在小鼠受精卵发育中的作用,将突变型和野生型Cdc25b转录成 mRNA,显微注射到小鼠受精卵中,放入含有或不含有dbcAMP的M16中,相差显微镜下观察受精卵卵裂情况;用蛋白激酶活性测定方法检测MPF的活性;利用Western 印迹检测Cdc2-Tyr15的磷酸化状态.结果显示,未加dbcAMP的Cdc25b- S321A mRNA注射组与Cdc25b-WT组相比,能够提前使受精卵发生G ₂/M期转变,导致卵裂,并明显提高卵裂率;MPF的活性测定和Cdc2-Tyr15磷酸化状态的检测结果也显示,Cdc25b-S321A组先于Cdc25b-WT组提前激活MPF.此外, Cdc25b-S321A mRNA注射组可以有效恢复由PKA引起的受精卵G ₂期阻滞,显著增加卵裂率;MPF的活性测定和Cdc2-Tyr15磷酸化状态的检测结果也显示,在PKA持续激活的情况下,对比于Cdc25b-WT组,Cdc25b-S321A组提前激活MPF.因此,在小鼠受精卵发育过程中PKA主要通过磷酸化Cdc25B的321位丝氨酸,从而调控MPF的激活与失活来控制有丝分裂进程.     

小鼠Cdc25B核输出序列

为探讨小鼠卵母细胞中Cdc25B(cell division cycle 25 homolog B)核输出序列在卵母细胞G2/M转换过程中的调控机制,应用显微注射方法将Cdc25B的野生型、N末端缺失1～51位氨基酸片段(Cdc25B-Δ51)、1～65位氨基酸片段(Cdc25B-Δ65)突变体的mRNA和pEGFP-Cdc25B-WT、pEGFP-Cdc25B-Δ51、pEGFP-Cdc25B-Δ65的融合质粒显微注射到含有完整生发泡的小鼠卵母细胞中,观察不同注射组小鼠卵母细胞发生生发泡破裂的情况及蛋白质亚细胞定位。结果显示Cdc25B-Δ51及Cdc25B-Δ65都丧失了诱导小鼠卵母细胞减数分裂的能力;同时亚细胞定位研究表明在G2期野生型Cdc25B主要分布在细胞浆中,Cdc25B-Δ51在核浆均有分布,Cdc25B-Δ65则主要分布于细胞核中。研究结果表明Cdc25B在52～65位氨基酸之间存在核输出序列(nuclear export sequence,NES),NES参与的核转运机制作为一种重要的调控机制控制着细胞的生理进程;N末端的氨基酸对减数分裂的重启动起促进作用。     

Cdc25B在小鼠受精卵的表达和定位

为阐明细胞分裂周期(Cdc)25B调控小鼠受精卵发育的机制,利用Western印迹检测小鼠受精卵各时期Cdc25B的表达及Cdc2-Tyr15的磷酸化状态。利用间接免疫荧光技术观察Cdc25B在小鼠受精卵的定位。构建pEGFP-Cdc25B融合表达载体并显微注射到受精卵中,观察Cdc25B在受精卵M期的定位变化。结果表明Cdc25B在G1和S期被磷酸化,在G2和M期去磷酸化。Cdc2-Tyr15在G1和S期处于磷酸化状态,G2期只检测到Cdc2-Tyr15轻微的磷酸化信号,M期未检测到任何Cdc2-Tyr15的磷酸化信号。Cdc25B在G1期定位于细胞质和细胞核中,S和G2期定位于细胞质的皮质部分,M期由细胞质转向核区。证明Cdc25B核输出后激活有丝分裂促进因子,从而启动小鼠受精卵的有丝分裂。     

胰岛素在小鼠受精卵早期发育中的作用

大量研究已经证实生长因子和激素在胚胎早期发育的细胞增殖与分化过程中起着重要的作用．应用定量ELISA,RT—PCR,免疫印迹和免疫荧光的方法检测胰岛素在小鼠受精卵和卵母细胞中的表达和定位．发现胰岛素均匀分布在卵细胞的胞浆中．同时也检测到mTOR（mammalian target of rapamycin）和p70S6K的表达、活性和定位．在小鼠受精卵中mTOR和p70S6K的表达没有明显不同．二者在G1,G2和M期分布在细胞浆,在S期聚集在原核的周围．在不同时期,mTOR的活性是波动的．利用P13K的特异性抑制剂渥曼青霉素,观察到卵裂率明显减低．当使用mTOR的特异性抑制剂雷帕霉素时,受精卵的第一次有丝分裂延迟．这些结果表明胰岛素存在于小鼠的卵母细胞和受精卵中,并且胰岛素可能通过激活P13K／PKB／mTOR／S6K的信号传导通路在小鼠的早期胚胎发育中发挥功能作用．