2017-2020年河南省漯河市呼吸道合胞病毒流行特征研究

呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)是引起严重急性呼吸道感染(Severe acute respiratory infection,SARI)的一个重要病原,尤其以5岁以下儿童为主.为了解河南省漯河市SARI住院患者中RSV感染的流行病学和临床特征,为RSV预防控制及临床诊疗提供科学数据,本研究采集2017年10月至2020年8月河南省漯河市SARI住院病例的咽拭子,并收集流行病学和临床信息.采用荧光定量PCR方法鉴定RSV A/B阳性病例,分析其流行病学和临床特征.结果显示,本研究共入组1335例SARI病例,其中220例(16.48％)为RSV阳性,A和B亚型分别占64.55％和30.45％.RSV感染以5岁以下儿童为主(占91.36％),2岁以下婴幼儿占RSV感染病例的一半以上(占55.37％).RSV流行高峰出现在11月-次年1月,不同年份流行季可前后相差一个月.A﹑B亚型在不同月份可单独流行也可共流行.受新型冠状病毒肺炎疫情影响,2020年2-8月SARI病例数较往年同期减少60％以上,RSV阳性率在2020年2-8月降低为0.与非RSV感染组相比,RSV更易感染2岁以下儿童,下呼吸道感染占比更高(以支气管肺炎为主).本研究通过近3年SARI病例监测,揭示河南省漯河市RSV感染以冬春季常见,以下呼吸道感染为主,主要感染5岁以下儿童,其中2岁以下婴幼儿是防控重点人群.新型冠状病毒肺炎流行期间,由于限制性防控措施的干预,RSV感染大大降低.本研究将为RSV疫苗和单克隆抗体等预防性干预手段的使用策略提供基础数据.     

模拟表位结合夹心化学发光法检测抗A和抗B效价

目的:获得A/B血型抗原的模拟多肽,并将其与夹心化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay, CLIA)相结合,以开发更有效的方法来测量A/B抗体的效价。方法:分别用NaM87-1F6和HEB-29对噬菌体12肽库进行三轮淘选。对经酶联免疫吸附实验(ELISA)确定的阳性菌斑进行测序分析,根据其氨基酸组成合成模拟多肽,并通过竞争性ELISA、凝集抑制等方法检测其抗原性。随后将获得的模拟多肽与CLIA结合,检测A、B抗体效价,制作标准曲线以及与现有的微柱凝胶法(CAT)进行相关性对比。结果:经过三轮淘选和相关鉴定后得到13个与抗A抗体和19个与抗B抗体特异性相互作用的噬菌体克隆,其中分别有9个(MTRIQLRMMRLH)和12个(PQMSRHRMRMLP)展示相同的氨基酸序列,据此合成的多肽分别命名为MTR和PQM。竞争性ELISA结果表明,MTR能够特异性拮抗A抗体和A抗原的替代多肽的免疫结合;PQM能够特异性拮抗B抗体和B抗原的替代多肽的免疫结合。凝集抑制实验表明MTR/PQM可以特异性抑制A/B型红细胞与抗A/B之间的相互作用。结合模拟肽的夹心CLIA具有较宽的线性范围(2-2048)和良好的线性相关系数(对于A抗体R~2=0.9566,对于B抗体R~2=0.9762)。基于CLIA方法和CAT测得的抗体滴度结果高度相关(P0.001)。结论:MTR和PQM有良好的A或B抗原性,具有成为其人工替代品的潜能。模拟多肽与夹心CLIA相结合能够实现对A、B抗体滴度的定量检测,且其结果准确可靠。     

人呼吸道合胞病毒F蛋白多肽免疫原性的初步研究

人呼吸道合胞病毒（Human respiratory syncytial virus,hRSV）是引起全球婴幼儿下呼吸道感染的最主要病原体。hRSV融合蛋白（Fusion protein,F）高度保守,是激发机体产生保护性抗体的主要靶向蛋白。目前,多种基于F蛋白设计的hRSV疫苗处于三期临床试验阶段,但尚未批准上市。本研究基于hRSV F蛋白设计的2条多肽PA(F蛋白,aa216-244)、PB(F蛋白,aa110-136),及其不同组合形式PM(PA和PB等量混合)、PL(PA和PB通过Linker连接),分别通过肌肉注射和滴鼻免疫BALB/c小鼠,评价多肽在小鼠体内的免疫效果。每只小鼠多肽的免疫剂量为25μg,分别于第0、14、28 d等剂量（加强）免疫一次。实验结果显示,与铝佐剂和CpG混合,多肽PA、PB、PM和PL肌肉注射均能诱导小鼠产生高滴度结合抗体,降低肺脏病毒载量,其中PB免疫组小鼠在hRSV活病毒攻毒后,体重恢复时间及肺病毒载量降低程度优于PM和PL免疫组和对照组;将多肽PM和PL通过不同途径免疫小鼠,滴鼻免疫组小鼠体重恢复时间和肺脏病理损伤程度优于肌肉注射免疫组。结...     

免疫磁珠技术分离唾液A/B血型抗原并用于吸附血清A/B抗体

目的:应用免疫磁珠分离技术获得具有良好抗原性的A/B血型抗原,并探究其作为ABO血型抗体吸附剂去除A/B抗体的可行性。方法:将含有血型物质的唾液进行预处理,再与包被了抗体的磁珠混合,分离出纯度较高的A/B抗原,运用酶联免疫及凝集抑制试验验证所得抗原的抗原性及是否存在交叉反应。用未纯化A/B抗原和纯化A/B抗原包被磁珠,对含有抗A/B IgM、IgG的血清进行抗体吸附,用纯化A/B抗原对100份来自O型血孕妇的临床血清样本进行抗体吸附,分别评价其吸附效果。结果:纯化抗原与对应抗体反应后,其吸光度显著高于对照组(A抗原与A抗体0.85±0.12 vs.0.27±0.03,P0.01;B抗原与B抗体0.86±0.09 vs.0.24±0.06,P0.01),与其它类型抗体反应后的吸光度值与对照组比较差异无统计学意义(P0.05)。进行红细胞凝集抑制试验时,纯化抗原可显著抑制相应抗体与红细胞的凝集反应,对其它类型抗体与红细胞的凝集没有抑制作用。血清抗体吸附实验表明纯化抗原的吸附效率比未纯化抗原的高(97.00%vs.88.00%,P0.001)。临床样本抗体吸附实验显示,纯化A抗原对抗A IgM/IgG的吸附效率分别为96.88%、98.44%;纯化B抗原对抗B IgM/IgG的吸附效率分别为96.88%、98.44%。结论:磁珠纯化抗原能特异性地与对应抗体结合,有效吸附血清中的血型抗体,有望作为合成A/B抗原的替代品。     

人呼吸道合胞病毒G蛋白在大肠杆菌中的表达及联合不同新型佐剂免疫效果的研究

人呼吸道合胞病毒（Human respiratory syncytial virus, hRSV）是导致5岁以下儿童和老人住院和死亡的主要原因。hRSV囊膜表面的融合蛋白F(Fusion protein, F)和吸附蛋白G(Attachment protein, G)均能诱导产生保护性中和抗体,但目前临床研究主要集中于F蛋白的亚单位疫苗及保护性单抗的研发,对G蛋白的研究较少。虽然G蛋白的高度糖基化导致其免疫原性较差,但使用佐剂能改善G蛋白的免疫效果。本研究利用大肠杆菌成功表达了hRSVA-Long株G蛋白膜外区67～298氨基酸（命名为REG）,并探索了REG与四种不同组合形式的新型佐剂联合免疫BALB/c小鼠的免疫效果：BFA03佐剂、B型CpG OND混合磷酸铝佐剂组合、C型CpG OND混合磷酸铝佐剂组合、BALB/c小鼠CD4+T细胞表位肽混合C型CpG OND和磷酸铝佐剂组合。对每只小鼠大腿肌肉多点注射100μL免疫原,初次免疫后第28天进行加强免疫。实验结果表明,接种REG联合新型BFA03佐剂的小鼠体内诱导产生结合抗体的能力最强,且其与接种REG蛋白联合B型CpG OND...     

人呼吸道合胞病毒感染性克隆构建及其验证

人呼吸道合胞病毒（Human respiratory syncytial virus, HRSV）是引起全球婴幼儿急性下呼吸道感染的重要病原体。本研究旨在建立HRSV原型株Long毒株的反向遗传操作系统。通过利用细菌人工染色体（Bacterial artificial chromosome,BAC）为载体骨架构建HRSV的Long毒株全长质粒（Long-BAC），以pcDNA3.1为载体构建分别表达HRSV N、P、M2-1和L蛋白（pcDNA3.1-N,pcDNA3.1-P,pcDNA3.1-M2-1和pcDNA3.1-L）的四个辅助质粒，将五个质粒共转染于表达T7 RNA聚合酶的BSR T7/9细胞系进行病毒拯救。采用间接免疫荧光（Immune fluorescence assay,IFA）和测序方法对拯救的病毒进行鉴定，并评价其在细胞和动物水平的生物学特征。本研究首次成功构建以BAC载体为骨架的HRSV原型株Long感染性克隆，拯救的病毒在不同代数测序结果显示无突变，能够稳定传代，病毒滴度为3×106 PFU/mL；与实验室保存野生型Long株（Long-WT）相比具有相似的细胞...