人TNF-α双顺反子逆转录病毒载体的构建及其在成纤维细胞中的表达

利用脑炎心肌炎病毒的内核糖体进入位点连接人ＴＮＦ－αｃＤＮＡ和选择基因ＮｅｏＲ基因,使ＴＮＦ－α及ＮｅｏＲ基因均受控于病毒ＬＴＲ启动子,将两基因同时转录至同一ｍＲＮＡ,从而构建成人ＴＮＦ－α双顺反子逆转录病毒载体ｐＧＣＥＮ／ＴＮＦ－α．在ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ介导下将其导入包装细胞ＰＡ３１７,Ｇ４１８筛选得单克隆,病毒滴度为１０６ＣＦＵ／ｍｌ重组病毒分泌的细胞株．经ＰＣＲ证明外源基因已整合至细胞基因组,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹显示出单一ＬＲＴ转录本．持续Ｇ４１８筛选能明显促进目的基因ＴＮＦ－α的表达．用重组病毒上清感染小鼠成纤维细胞ＮＩＨ３Ｔ３,Ｇ４１８筛选获得的混合抗性克隆持续高表达ＴＮＦ－α,４０Ｇｙγ线照射后能维持高效表达至７ｄ．实验结果表明,含ＩＲＥＳ的双顺反子逆转录病毒载体将是一个很好的基因转移载体．     

细菌内同源重组法制备mIL-12腺病毒载体及其体外高效表达

利用细菌内同源重组法构建含 m IL- 1 2双顺反子重组腺病毒载体 ,其中由 polio IRES连接的 m IL- 1 2 p40和 p35双亚基目的基因片段用 Not +Xho 酶自真核表达载体 pc DNA3/m IL- 1 2中切出 ,亚克隆至经同样酶切的腺病毒穿梭质粒中 ,形成转移质粒 p Adtrack- CMV/m IL- 1 2 ,对之线性化后与腺病毒基因组质粒 p Adeasy- 1共转化 BJ51 83菌 ,抽提经鉴定含目的基因的重组体质粒DNA,转染 2 93细胞 ,包装成重组体腺病毒 Ad- m IL - 1 2 . Southern杂交证实 ,p40和 p35基因已被克隆至 Ad- m IL - 1 2基因组中 ;RT- PCR结果显示 ,Ad- m IL- 1 2感染的 MM45T· Li肿瘤细胞中有p40和 p35基因的表达 ,ELISA检测感染 48h细胞的上清中 m IL- 1 2的含量达 88ng每 1 0 6细胞 ,其体外能刺激小鼠脾脏淋巴细胞的增殖 ,提高 NK细胞活性及诱导 干扰素的产生 .结果表明 ,利用细菌内同源重组法制备的 Ad- m IL- 1 2重组腺病毒载体是一种方便、高效、成功率高的方法 ,所制备的重组体腺毒在体外能有效表达具有生物活性的 m IL- 1 2 ,为今后的体内应用奠定了基础 .     

含人TNF-α、IL-2及NeoR基因多顺反子逆转录病毒载体的构建及表达

利用脑炎心肌炎病毒和脊髓灰质炎病毒的内核糖体进入位点,连接人ＴＮＦ－α及ＩＬ－２ｃＤＮＡ和选择基因新霉素磷酸转移酶基因（ＮｅｏＲ）,使ＴＮＦ－α、ＩＬ－２及ＮｅｏＲ基因均受控于病毒ＬＴＲ启动子,将这３个基因转录至同一ｍＲＮＡ,从而构建成含人ＴＮＦ－α、ＩＬ－２及ＮｅｏＲ基因多顺反子逆转录病毒载体ｐＧＣＥＮ／ＴＲＩ。在ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ介导下将其导入包装细胞ＰＡ３１７,Ｇ４１８筛选得单克隆,病毒滴度为５×１０５ＣＦＵ／ｍｌ重组病毒分泌的细胞株,经ＰＣＲ证明外源基因已整合至基因组,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹显示出单一转录本。用重组病毒上清感染不同的细胞,Ｇ４１８筛选所获得的抗性克隆能不同程度地表达ＴＮＦ－α及ＩＬ－２。实验结果表明,含ＩＲＥＳ的多顺反子逆转录病毒载体能很好地在同一靶细胞中表达多个外源基因。     

基因工程成纤维细胞的研究进展

基因工程成纤维细胞的研究进展唐展云陈诗书（上海第二医科大学人类基因治疗研究中心,上海２０００２５）关键词基因工程成纤维细胞基因治疗在基因治疗中,靶细胞的选择非常重要。靶细胞的选择必须具备以下条件：容易获得;能在体外培养和做遗传学修饰;便于植回体内和能...     

小鼠白细胞介素12双顺反子真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

克隆小鼠白细胞介素１２（ＩＬ－１２）ｐ４０及ｐ３５ｃＤＮＡ,并构建同时含ｍＩＬ－１２ｐ４０和ｐ３５ｃＤＮＡ的双顺反子真核表达载体及其在哺乳动物细胞中的表达．白细胞介素１２是由巨噬细胞,树突状细胞等抗原提呈细胞产生的一种异二聚体细胞因子,对机体的细胞免疫功能起着重要的调节作用．利用脂多糖（１００ｐｇ／ｍｌ）和小鼠重组干扰素（ＩＦＮ－γ５００Ｕ／ｍｌ）体外联合刺激小鼠腹腔巨噬细胞,从中提取总ＲＮＡ,经ＲＴ－ＰＣＲ扩增出含信号肽的小鼠白细胞介素１２（ｍＩＬ－１２）ｐ４０及ｐ３５全长ｃＤ－ＮＡ．ＰＣＲ产物经酶切后,分别克隆至ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＳＫ载体中,序列测定结果与文献报道序列一致．然后利用脊髓灰质炎（Ｐｏｌｉｏ）病毒内核糖体进入位点（ＩＲＥＳ）连接ｍＩＬ－１２ｐ４０及ｐ３５ｃＤＮＡ,亚克隆至ｐｃＤＮＡ３载体中,构建成含ｍＩＬ－１２ｐ４０及ｐ３５ｃＤＮＡ双顺反子真核表达载体,即ｐｃＤＮＡ３／ｍＩＬ－１２,ｐ４０及ｐ３５ｃＤＮＡ同时受ｐｃＤＮＡ３中ｈＣＭＶ启动子驱动,将ｐ４０及ｐ３５转录至同一ｍＲ－ＮＡ上．通过ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ将ｐｃＤＮＡ３／ｍＩＬ－１２转染ＣＯＳ－７细胞,７２ｈ收集培养上清,测定ｍ