衣原体疫苗的进展

衣原体在人类、哺乳动物和鸟类中会引起各种疾病。对人类和动物的健康及全球农业生产会产生重大影响。人的2种主要衣原体病原体是沙眼衣原体和肺炎衣原体(Chlamydophila pneumoniae)。沙眼衣原体会引发慢性结膜炎等,是人类最普通的性传播疾病,感染为隐性过程,如果不治疗,     

细胞密度和营养供给对H1N1流感病毒产率的影响

探究细胞培养生产流感病毒过程中,高细胞密度引起低单位细胞病毒产率(Svy)的原因及找到解决方法。通过增加微载体浓度以及换液操作获得较高的细胞密度;考察了感染时细胞密度(CCI)和病毒感染用维持培养基对病毒产量和单位细胞病毒产率的影响。在12.6 g/L微载体培养过程中,通过换液操作,可获得高细胞密度,达到1.47×107 cells/m L。在CCI为1×107cells/m L条件时,选择合适的维持培养基,其Svy最高达到5.14×103 virions/cell,比同等条件下用DMEM维持培养基的Svy值提高了近一倍。高密度培养MDCK细胞生产流感病毒时,充分考虑不同阶段的培养条件和营养需求,可以提高细胞密度和单位细胞病毒产率,进而提高流感病毒的产量。该研究结果为工业化生产流感病毒疫苗提供了基础数据。     

MDCK细胞宿主蛋白含量双抗体夹心ELISA检测方法的建立

目的建立检测犬肾细胞(madin-darby canine kidney, MDCK)宿主细胞蛋白(host cell protein, HCP)含量的双抗体夹心ELISA。方法从MDCK细胞中提取细胞总蛋白,免疫新西兰兔制备兔抗MDCK细胞蛋白多克隆抗体,抗体经辛酸-硫酸铵沉淀和Protein A层析纯化后,采用SDS-PAGE分析抗体纯度,Western blot检测抗体特异性。用纯化的多克隆抗体作为包被抗体,并采用改良过碘酸钠标记法制备酶标抗体,建立ELISA并确定包被抗体浓度和辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体稀释度等最适条件。确定该方法较佳的线性范围及检测限,并对该法特异性、准确度、精密性和重复性进行验证。最后,用该方法分别对接种流感病毒的MDCK细胞上清收获液和纯化样品进行MDCK细胞蛋白含量检测,初步验证其在纯化工艺开发中的适用性。结果通过免疫新西兰兔制备了高滴度的兔抗MDCK细胞蛋白多克隆抗体血清,滴度可达1∶8 000。纯化后的兔抗MDCK细胞蛋白多克隆抗体纯度>90%,并可与MDCK细胞蛋白特异性结合。建立的双抗体夹心ELISA的理想包被抗体质量浓度为10μg/mL,酶标抗体的工作浓度为1∶500稀释。该方法的线性范围为50~2 500 ng/mL,检测限为50 ng/mL;该方法对Vero细胞、293T细胞和Mrc-5细胞等其他细胞HCP无交叉反应,特异性良好;不同浓度的MDCK细胞HCP回收率在98.5%~111.9%之间,变异系数均<10%。接种流感病毒的MDCK细胞培养上清经多步纯化后MDCK细胞蛋白质量浓度逐渐降低至<900 ng/mL,纯化工艺可有效去除MDCK细胞蛋白残留。结论建立双抗体夹心ELISA检测MDCK细胞残余HCP含量的方法,可用于基于MDCK细胞培养的流感疫苗下游工艺开发中宿主细胞残留HCP含量监测。     

重组胰酶在四价流感病毒裂解疫苗(MDCK细胞)制备中的应用

目的 探究使用重组胰酶(recombinant trypsin, RT)替代N-(对甲苯磺酰基)-L-苯基乙基氯甲基酮(N-p-Tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone, TPCK)处理的牛源胰蛋白酶(TPCK-trypsin, TT),在基于无血清悬浮细胞培养的四价流感病毒裂解疫苗制备中的可行性。方法 用不同浓度的RT处理无血清悬浮培养的犬肾细胞(madin-darby canine kidney cell,简称MDCK细胞),检测其对细胞密度和细胞活力的影响。在流感病毒感染环节添加不同浓度的RT,在不同时间细胞收获病毒液，检测病毒滴度，确定适合的RT浓度。在2μg/mL RT的条件下，接种不同(亚)型流感病毒毒株，以检测不同时间病毒滴度及细胞密度，并在3 L生物反应器中验证RT对流感病毒扩增的影响。结果 当RT浓度<5μg/mL时，对无血清悬浮培养的MDCK细胞生长密度和细胞活力均无显著影响；在病毒感染与扩增过程中，添加终浓度为2μg/mL RT可保证不同(亚)型流感病毒疫苗株的有效扩增。其中，H1N1、H3N2、B/Vic、B/Ya...