大鼠N型钙通道ⅢP区原核表达、纯化及活性研究

高保真PCR克隆出编码大鼠海马组织N型钙通道α1B亚基ⅢP区的DNA序列,分别与表达载体pET28b和pGEX-4T-1连接,转化入能补充稀有密码子tRNAs的大肠杆菌Rosetta菌株中,通过优化表达条件,实现了高效诱导表达．再通过低温诱导,将包涵体用尿素溶解再稀释后透析法复性、酶切、亲和柱层析等方法得到较纯的可溶性目的蛋白HIS-Cav22P、GST-Cav22P和Cav22P,紫外吸收光谱检测实验证明了重组蛋白HIS-Cav22P能和钙离子可逆地结合．最后通过GST沉降实验证明了芋螺毒素SO3与Cav22P存在体外相互结合作用．上述结果为揭示芋螺毒素SO3特异性阻断大鼠海马组织N型钙流的分子机制提供了直接的依据,也为建立筛选新的非吗啡型天然镇痛药物的技术平台提供了基础．     

合浦珠母贝外套膜细胞engrailed、BMP2和Smad3的mRNA表达水平的相关性

软体动物engrailed蛋白和骨形成相关蛋白对胚胎贝壳区域边界形成可能具有重要作用,engrailed还被推测为调节基质蛋白在外套膜组织区域化表达的重要调控因子．因此,弄清调控engrailed在软体动物中特征表达的分子机制有着重要的研究意义．但是,由于贝类基因组测序尚不完整,目前也没有建立获得贝类细胞系,以致于许多预测可能参与调控的基因需要通过克隆来鉴定,而且经典的研究细胞信号通路的方法也很难得到应用．目前,在中国南海广泛养殖的合浦珠母贝中,已获知其BMP2和Smad3的cDNA全长,以该贝的基因组为模板,PCR扩增获得了一段engrailed编码区片段．经软件分析,该片段含有EH4结构域,且与其他物种engrailed蛋白具有很高的同源性．研究的贝中,特别是外套膜组织中,engrailed、BMP2和Smad3三者表达之间的相关性,将有助于我们理解贝壳形成的分子机制．贝壳缺刻后半定量PCR试验结果表明,三者均参与贝壳修复,且在贝壳缺刻后的修复过程中,engrailed和Smad3的mRNA表达变化规律非常相似,提示它们之间可能存在相互影响的联系．用地塞米松(DXM)和过氧化氢(H₂O₂)分别处理原代培养的贝外套膜组织迁出细胞,实时相对定量PCR检测engrailed、BMP2和Smad3的mRNA表达水平,统计分析结果表明,三者具有显著的相关性．上述所有结果为进一步研究贝类生物矿化的发育和信号转导机制提供了新的思路和基础．