黑曲霉h408阿魏酸酯酶基因的克隆及在毕赤酵母中的高效表达

【目的】实现在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中高效表达黑曲霉(Aspergillus niger)h408阿魏酸酯酶A基因(AnfaeA),并对重组酶特性进行表征。【方法】采用重叠延伸PCR扩增黑曲霉h408的阿魏酸酯酶A基因。将AnfaeA基因和毕赤酵母表达载体pPIC9K连接,成功构建重组质粒pPIC9K-Anfae,经线性化后电转化P.pastoris GS115,透明圈法筛选活性高的转化子后进行诱导表达。利用紫外吸收法测定温度及pH对重组阿魏酸酯酶活性的影响。【结果】成功从A.niger h408中克隆得到阿魏酸酯酶A的cDNA基因(GenBank:KF911349),并实现了其在P.pastoris GS115中的高效表达。该基因长度为783bp,含有1个开放阅读框架(ORF),编码260个氨基酸,Blast分析显示该基因和GenBank中黑曲霉阿魏酸酯酶序列同源性为99%。翻译的氨基酸序列含有脂酶典型的活性盖子和催化三联体结构。从转化板上获得1株编号为pPIC9K-Anfae5的转化子阿魏酸酯酶活性最高,酶活达24.72 U/mL,比活力为40.84 U/mg,比黑曲霉出发菌株(22.1 mU/mL)提高了1100倍左右。重组阿魏酸酯酶的最适pH为5.0,且在pH 4.0-9.0稳定性较好;最适反应温度50℃,在40-60℃时较稳定。【结论】阿魏酸酯酶在毕赤酵母中的高效分泌表达为其在饲料工业和造纸工业等工业化应用提供了前提,也为后续改进酶学特性的定向进化奠定实验基础。     

阿魏酸酯酶基因工程菌研究进展

阿魏酸酯酶能水解阿魏酸、多聚阿魏酸与木聚糖以及木质素之间形成的酯键,有利于植物细胞壁的降解。介绍阿魏酸酯酶的微生物来源、阿魏酸酯酶基因工程菌构建和阿魏酸酯酶与其他酶相互协同作用等的研究进展。     

一株产阿魏酸酯酶丝状真菌的分离鉴定及其粗酶性质研究

利用平板透明圈法,筛选分离到37株具有阿魏酸酯酶活性的丝状真菌,其中1株编号为HA4087的菌株具有较强的产阿魏酸酯酶能力。经形态学观察、18S rDNA和ITS序列鉴定为互隔交链格孢霉。对该菌株所产阿魏酸酯酶的粗酶性质进行了初步研究,结果表明,在发酵培养基中发酵粗酶活力为86 mU/mL,最适作用温度为55℃,最适pH值为5.5;在55℃保温30 min后酶活力仍为90%以上;在pH4.5-6.5范围内稳定性较好,酶活仍为85%以上。试验获得了产高酶活阿魏酸酯酶的菌株,为阿魏酸酯酶的工业化应用提供前提。