nm23-H1基因转染前后人高转移大细胞肺癌细胞株双向凝胶电泳图谱分析

为了更全面地了解nm23-H1在肺癌中发挥转移抑制的机理,用双向凝胶电泳技术比较人高转移大细胞肺癌细胞株(L9981)和转染nm23-H1基因的人大细胞肺癌细胞株(L9981-nm23-H1)间蛋白表达的差异.利用固相pH梯度双向凝胶电泳分离人高转移大细胞肺癌细胞株(L9981)和转染nm23-H1基因的人大细胞肺癌细胞株(L9981-nm23-H1)的总蛋白,用图像分析软件比较分析以识别细胞间的差异表达蛋白质.结果成功地获得了两株细胞蛋白组分辨率高、重复性好的双向凝胶电泳图谱.软件分析两种细胞的凝胶电泳图谱后发现,在相同分析条件下识别的蛋白质斑点数L9981为902±169个、L9981-nm23-H1为1160±212个.比较L9981和L9981-nm23-H1人大细胞肺癌细胞株的双向凝胶电泳蛋白质图谱后发现6个蛋白质点仅在L9981中有表达,17个蛋白质点仅在L9981-nm23-H1中有表达.此外,发现13个在两种细胞株中均存在,但表达量差异在2倍以上的蛋白质点(P<0.05).结果提示,nm23-H1基因转染引起人高转移大细胞肺癌细胞株蛋白质表达谱的变化,可能是其逆转肺癌侵袭转移的生物学基础.     

新型的DNA金属化制作工艺

生物与微细加工技术的结合日益成为一种新趋势,DNA分子具有热力学上的稳定性、线性的分子结构及机械刚性等优点,可以作为制备纳米线的理想模板。通过DNA为模板的金属化,形成导电性好的金属纳米线和金属团簇的纳米结构,使得DNA分子作为纳米导线构筑纳米器件成为可能。在本文中,我们对几种具有代表性的DNA金属化工艺的原理进行了讨论,研究了其新型的制作工艺,通过进一步的自组装和自识别技术,金属化过的DNA就可以被用来构建电路,并作为后续的金属沉积模板,在构筑生物纳米器件的领域将有广阔的应用前景。     

人端粒酶催化亚单位启动子调控自杀基因HSV-TK肿瘤细胞特异性表达载体的构建

将自杀基因形插入质粒pGL3-hTp和pGL3-Control中,取代其上的荧光素酶基因,分别构建hTERT启动子和SV40启动子调控的TK基因表达质粒pGL3-hWp-TK和pGL3-SV40-TK,酶切和PCR鉴定结果显示重组质粒pGL3-hTp-TK和pGL3-SV40-TK构建成功;用脂质体法将pGL3-hTp-TK和pGL3-SV40-TK瞬时转染端粒酶阳性的人肺腺癌细胞株A549及端粒酶阴性的人胚肺成纤维细胞株MRC-5,RT-PCR显示转染pGL3-SV40-TK的细胞A549和MRC-5均有TK mRNA表达,转染pGL3-hTp-TK的A549细胞中也有形mRNA表达,但转染pGL3-hTp-TK的MRC-5细胞无TK mRNA表达,提示hTERT启动子可以调控自杀基因HSV-TK在肺癌细胞中靶向表达,可能是肿瘤靶向性基因治疗中比较理想的转录调控元件．     

nm23-H1基因缺失人肺癌细胞株的筛选与鉴定

nm23一Hj基因与肺癌的侵袭与转移密切相关,但是其作用的分子机制尚不清楚,为研究nm23—141基因的功能,筛选并鉴定了nm23一H,基因缺失人肺癌细胞株及其生物学特性．应用SoutheITIblot．RT—PCR和West—elTl blot检测9株人肺癌细胞株中nm23—14,基因的存在状态及其生物学行为．结果发现发现人大肺癌细胞株L9981中存在nm23—141等位基因的杂合性缺失,与其同源的NL9980及其它7株肺癌细胞株中nm23—111基因均以杂合子的形式存在;并且L998l细胞株的增殖能力、克隆形成能力、体外侵袭力．裸鼠体内成瘤性及移植瘤肺转移的能力均显著高于NL9980．研究结果显示nm23一H,基因的缺失可能与L998l细胞株恶性表型和高转移潜能密切相关．     

高效原核表达载体pBV220的改造与应用

以高效原核表达载体 pBV220为骨架载体,应用单链寡核苷酸引物插入法在pBV220多克隆位点的下游插入了六聚组氨酸融合标签编码序列(6×His-Tag)、羟胺和凝血酶蛋白切割位点, 并增加了Xho I和Kpn I酶切位点和强终止密码子TAA, 将此新质粒命名为 pBV223。以此载体表达的目的蛋白在羧基端(C端)带有六聚组氨酸尾以利于通过固定化金属亲和层析快速纯化目的蛋白, 酶切及核苷酸序列分析验证了我们的设计。将终止密码缺失突变的nm23-H1 cDNA克隆入pBV223载体中, 在大肠杆菌DH5a中成功地表达了Nm23-H1蛋白, 通过镍(Ni)亲和层析一步即简单、快速地得到了纯化蛋白。我们所应用的单链寡核苷酸引物插入直接进行定向克隆的方法是目前为止最简便的方法。     

利用Pyrobest DNA聚合酶一步法进行大片段基因的定点突变

目的:介绍一种简单、快速、高效和经济的进行大片段基因定点突变的方法。方法:小量抽提含有NM23H1-EGFP融合基因的逆转录病毒真核表达质粒pLXSN-NM23H1-EGFP,体外合成突变引物对,利用高保真Pyrobest DNA聚合酶对质粒DNA进行PCR突变反应,然后用DpnⅠ限制性内切酶消化PCR产物以去除模板DNA,取适量消化产物转化大肠杆菌XL1-Blue,随机挑选克隆进行测序筛选、鉴定所需突变株。结果:在NM23H1-EGFP基因中引入了S44A、P96S、H118F、S120G、P96S-S120G等5个替换突变位点及9bp处的插入突变。结论:该方法简单、快速、高效、经济,不须纯化中间产物,不须亚克隆,突变效率几乎为100%,是一种值得推广应用的方法。     

nm23-H1基因转染L9981肺癌细胞前后基因表达谱的变化

应用基因芯片检测L9981细胞转染nm23-H1基因前后细胞基因表达谱的改变.提取L9981细胞转染nm23-H1基因前后细胞的总RNA,纯化为mRNA后再转录为cDNA.cDNA经限制性内切酶Sau3AI消化后,cDNA片段分别用cy3和cy5标记,与定制的包含14000个基因芯片杂交.杂交结果经扫描和软件分析,nm23-H1基因转染L9981细胞后发现1156(8.26%,1156/14000)个基因表达上调,而642(4.59%,642/14000)个基因表达下调.涉及基因包括信号传导、癌基因与抑癌基因、转移相关基因、细胞周期与凋亡、细胞外基质与细胞骨架相关基因,以及细胞因子和转录因子等.nm23-H1基因是通过对转移相关基因的调节来发挥其抑制肺癌细胞株L9981侵袭和转移作用的.