人健康肝组织刀豆凝集素(Con A)结合型糖蛋白组学研究

通过凝集素亲和层析技术结合双向电泳-质谱技术构建人健康肝组织Con A结合型糖蛋白数据库并进行生物信息学分析; 利用研磨和匀浆两步法抽提人健康肝组织总蛋白, 通过固相凝集素亲和层析获得与刀豆凝集素(Con A)结合型糖蛋白, 经过双向电泳、荧光染色、图像分析获得人健康肝组织表达谱; 通过MALDI-TOF-MS质谱鉴定及生物信息学分析获得人健康肝组织数据库, 并建立了高重复性的人健康肝组织Con A结合型糖蛋白表达谱, 图谱均点数为301±15, 挖取139个蛋白点进行质谱鉴定, 去冗余后确定了85个与细胞周期、代谢通路相关的蛋白质; 通 过NetNGlyc和NetOGlyc对糖基化位点进行预测, 并按照geneontology对其功能定位等进行分类, 并对其中与肿瘤发生发展相关的蛋白进行具体分析. 由此可见, 凝集素亲和层析结合2－DE, 质谱鉴定是一种高通量的检测方法, Con A结合型糖基化修饰谱的构建为后续研究奠定了基础.     

热休克蛋白27在转移潜能不同人肝癌细胞系中的表达及机制研究

利用不同转移潜能肝癌细胞系探讨热休克蛋白27(HSP27)参与肝癌细胞转移潜能形成的可能分子机制.细胞免疫荧光技术、RT-PCR和免疫印迹技术显示,HSP27在转移潜能不同的肝癌细胞Hep3B、MHCC97L和MHCC97H中定位于细胞浆,亦可见于细胞核,HSP27 mRNA和蛋白质的表达水平与肝癌细胞转移潜能呈正相关.高转移潜能肝癌细胞系MHCC97H的HSP27 RNA干扰试验结果显示,HSP27 RNA干扰后MHCC97H的侵袭(MHCC97H组:21.36±2.92;对照RNAi组:19.88±2.23;RNAi组:11.40±2.05)、运动能力(MHCC97H组:26.35±3.29;对照RNAi组:24.43±3.17;RNAi组:10.92±2.27)明显减弱,细胞凋亡显著增加(MHCC97H组:15.12%;对照RNAi组:17.56%;RNAi组:27.64%).同时进行信号转导基因芯片检测发现,HSP27干扰后核因子κB(NF-κB)通路抑制,并且免疫印迹显示细胞核内活化的NF-κBp65减少,细胞内磷酸化IκBα降低.另外,免疫共沉淀检测发现,在肝癌细胞内HSP27可与IKKβ、IκBα共沉淀,且在HSP27RNA干扰后IKKβ与IKKα结合能力下降.这些结果提示,HSP27可能通过参与细胞内NF-κB通路的激活,影响细胞凋亡和细胞运动,在肝癌细胞侵袭转移过程中发挥作用.     

双向电泳-质谱技术筛选肝癌血清标记物

采用双向电泳 - 质谱技术筛选肝癌特异的血清蛋白标记物,以利于肝癌的早期诊断和治疗 . 肝癌、肝炎和正常三组各 20 例血清先采用超声、高丰度蛋白去除、脱盐预处理以优化双向电泳,图像分析三组血清图谱寻找差异点,基质辅助激光解吸飞行时间质谱对差异点进行鉴定 . 结果显示,通过样品预处理,血清上样体积平均增加 3 ～ 4 倍,参考胶点数由 218 个增至 332 个,白蛋白和免疫球蛋白明显减弱,水平条带明显减少 . 图谱比较所得 37 个差异点,经鉴定为 7 种蛋白 . 与正常组比较,转铁蛋白、甲状腺素运载蛋白在肝炎和肝癌组低表达,α-1 抗胰蛋白酶、凝聚素、铜蓝蛋白、触珠蛋白在肝炎和肝癌组均高表达 . α-1 抗胰蛋白酶在肝癌组较肝炎组高表达,而热休克蛋白 27 只在肝癌组表达 . 上述结果提示,双向电泳-质谱技术可发现肝癌发生发展过程中血清蛋白表达谱质或量的变化,从而为肝癌的早期诊断及治疗奠定基础 .     

转移潜能不同人肝癌细胞系差异蛋白Annexin1的功能解析

解析比较蛋白质组学筛出的差异蛋白Annexin1的生物学功能,证实其是否在肝癌转移复发中发挥作用. 分别以RT-PCR、蛋白质印迹及细胞免疫化学对差异蛋白Annexin1在转移潜能不同人肝癌细胞系中的表达情况进行再验证,然后构建Annexin1反义表达质粒,转染高转移潜能人肝癌细胞系MHCC97H,通过对MHCC97H细胞的运动、侵袭、凋亡、生长周期、MMPs分泌、克隆形成等系列检测,观察目的蛋白表达降低对其生物学行为的影响,特别是转移特性的影响. 验证结果均证实Annexin1在有转移潜能人肝癌细胞系MHCC97L、MHCC97H中呈高表达. 转染Annexin1反义重组表达质粒后,MHCC97H细胞中Annexin1的表达被成功抑制. 依据MHCC97H/pcDNA3.1(+) AS Annexin1,MHCC97H/ pcDNA3.1(+),MHCC97H的检测排序,转染反义重组质粒后的MHCC97H细胞穿过上室底膜的细胞数 (运动实验) 分别为：11.13±3.31,18.88±2.03,21.86±3.38;穿过人工基底膜细胞数 (侵袭实验) 分别是：16.43±2.23,16.40±1.57,16.86±1.52;细胞平均集落形成率 (克隆形成实验) 分别为：(14.33±0.46)%,(19.35±0.49)%,(20.25±0.35)%;MHCC97H细胞凋亡比例 (FCM分析) 依次为22.2%,6.44%,6.97%;细胞周期各时相的比例依次为：G0-G1期79.5%/76.34%/80.5%,S期13.26%/14.4%/9.69% ,G2-M期7.25%/9.26%/9.81%;细胞培养上清MMP9的定量结果依次为：26.37 μg/L,28.00 μg/L,31.90 μg/L;MMP2定量结果依次为29.46 μg/L,26.37 μg/L,26.53 μg/L. 明胶酶谱分析细胞培养上清显示,转染Annexin1反义重组表达质粒的MHCC97H细胞分泌的MMP9活性与对照比变化不明显. 综合上述结果发现,转染Annexin1反义表达质粒MHCC97H细胞运动能力及集落形成率明显降低,凋亡细胞的比例增加,而侵袭潜能,细胞周期时相,细胞分泌MMP2、MMP9的量均变化不明显. 提示,差异蛋白Annexin1可能通过影响细胞凋亡和细胞运动在肝癌细胞侵袭转移过程中发挥作用.     

人肝癌细胞系的糖蛋白质组学研究

糖基化是最重要的蛋白质翻译后形式之一,糖基化蛋白的糖链部分影响着蛋白质的折叠和稳定性以及其生物学功能.许多恶性肿瘤组织与正常组织相比已显示出蛋白质糖基化的差异.采用蛋白质组学分析方法结合先进的糖蛋白荧光染色技术,研究了正常人肝细胞系(ChangLiver)和人肝癌细胞系(Hep3B)糖蛋白糖基化的差异.首先用细胞裂解法提取细胞总蛋白质,进行双向电泳(2-DE),然后用pro-QEmerald488糖蛋白荧光染料进行糖蛋白染色,得到两种细胞系糖基化蛋白表达谱,经2-DE分析软件Dymension分析2-DE图像,比较糖蛋白的糖基化程度,并对糖基化蛋白进行质谱鉴定.结果显示正常人肝细胞表达(74±2)个(n=3),而人肝癌细胞系表达(78±3)个糖蛋白(n=3).两者匹配的糖蛋白质点31个,Hep3B表达而ChangLiver不表达的糖蛋白质点47个,ChangLiver表达而Hep3B不表达的糖蛋白质点43个.两种细胞系糖基化程度存在明显差异,与正常人肝细胞相比,肝癌细胞发生糖基化改变的糖蛋白有25个,其中糖基化水平上调的有10个,下调的有15个,质谱鉴定出12个发生糖基化改变的糖蛋白.这些结果显示蛋白质糖基化改变可能在肝癌的发生和发展中起一定作用.