重组人骨形态发生蛋白2在CHO细胞中的表达、鉴定及活性分析

构建真核表达载体pCDNA3.1( )-hBMP-2,与质粒pSV2-dhfr共转染CHO-dhfr-细胞,以含有700μg/mLG418的IMDM进行选择性培养,筛选抗性克隆,并用MTX扩增,提高rhBMP-2的表达量。收集的rhBMP-2蛋白进行Westernblot检测,还原蛋白样品电泳产生一条大小约为18kD的特异性条带,非还原蛋白样品电泳产生一条大小约为30kD的特异性条带,提示表达的rhBMP-2是经过糖基化修饰的,且以同源二聚体形式分泌表达。单细胞分离培养得到14株rCHO(hBMP-2)单克隆细胞株,ELISA法检测rhBMP-2表达水平,最高可达7.83μg/24h/106cells。活性分析结果表明,表达的rhBMP-2具有很强的生物学活性。     

利用同源蛋白的信号肽和前肽序列在CHO细胞中表达重组人BMP6

BMP6属于TGF-β超家族,具有较强的骨诱导作用。主要利用BMP6自身的信号肽、前肽与成熟肽基因序列构建了表达质粒pcDNA-BMP6;同时利用BMP2的信号肽、前肽与BMP6的成熟肽基因序列构建了表达质粒pcDNA-BMP2/6。将两种质粒分别瞬时转染Cos7细胞,发现质粒pcDNA-BMP2/6表达rhBMP6的效率高于质粒pcDNA-BMP6。然后将质粒pcDNA-BMP2/6与含二氢叶酸还原酶基因(dhfr)的表达质粒共转染dhfr缺陷型的中华仓鼠卵巢(CHO)细胞,经G418筛选、氨甲蝶呤(MTX)介导目的基因扩增、亚克隆后得到表达rhBMP6成熟肽的单克隆细胞株。将表达产物rhBMP6初步纯化后,能诱导前成肌细胞系C2C12向成骨细胞方向转化,显示其具有骨诱导作用。