水稻OsRacD蛋白G15V、T20N点突变对其细胞定位的影响及其与靶蛋白的相互作用

OsRacD是水稻小GTP结合蛋白Rho家族成员,功能之一是作为“分子开关",通过控制花粉管的延伸生长,参与光敏核不育水稻光周期育性转换过程. 为研究该蛋白的作用机制,采用重叠延伸PCR方法,分别在其GTPase结构域中引入G15V、T20N点突变,模拟GTP和GDP结合形式的OsRacD. 进一步构建了受控于CaMV35S的与绿色荧光蛋白融合表达的双元植物表达载体;采用农杆菌介导法转化洋葱表皮细胞,在荧光显微镜下观察蛋白在活细胞内定位的特点. 结果显示,野生型蛋白在细胞质和细胞膜都有分布,组成型激活的蛋白主要分布在细胞膜上,而失活型蛋白则大都集中到细胞核周围. 蛋白相互作用的酵母双杂交体系分析显示,OsRacD及其2个突变体具有不同的靶蛋白结合特性. 研究证实,水稻OsRacD蛋白G15V和T20N点突变不仅影响其在活细胞内的定位,而且也影响了与靶蛋白的相互作用.说明处于不同鸟苷酸结合状态的OsRacD具有不同的胞内定位方式,可能通过结合不同的靶蛋白,引发不同的细胞应答事件.     

CRISPR/Cas9技术编辑OsRhoGDI2基因导致水稻半矮化

OsRhoGDI2是通过酵母双杂交从水稻幼穗中分离的一个与Rho蛋白家族成员OsRacD相互作用蛋白的编码基因,但功能尚不明确。本研究利用CRISPR/Cas9技术创制水稻OsRhoGDI2基因敲除突变体。检测结果表明,转基因水稻T0代获得2种纯合突变体,T1代获得8种纯合突变体。序列分析显示,在敲除水稻中,该基因的编辑靶点附近发生了碱基的替换或缺失,预期生成丧失RhoGDI保守结构域的截短蛋白。表型比对分析发现,敲除水稻与对照相比,株高显著降低,统计学分析结果显示,敲除水稻株高降低源于第Ⅱ和第Ⅲ茎节的缩短,提示OsRhoGDI2基因可能与水稻株高控制相关。     

T20N点突变对水稻OsRacD蛋白GTP酶活性的影响

OsRacD是水稻小GTP结合蛋白Rho家族成员,其功能之一是作为“分子开关”,通过控制花粉管的延伸生长,参与光敏核不育水稻光周期的育性转换。在序列同源性比对和蛋白保守结构域分析的基础上,采用重叠延伸PCR方法在水稻OsRacD基因的第一个高度保守的基序G1区引入T20N点突变,模拟GDP结合形式的OsRacD。进一步构建了与组氨酸标签融合的原核表达载体,原核表达和纯化了野生型和突变型OsRacD蛋白,并通过Western blot证实了融合蛋白表达和纯化的正确性。纯化蛋白的GTP酶活性检测结果显示,突变后的OsRacD蛋白GTP水解活性显著降低,提示OsRacD在T20N突变前后具有不同的生化特性。