地方医科大学实验动物管理工作水平评价指标体系的构建

目的构建地方医科大学实验动物管理工作水平评价指标体系,为高校实验动物管理工作的评价提供参考。方法根据研究主题确定咨询专家人选37人,采用Delphi法进行问卷调查和统计分析。结果两轮咨询问卷回收率分别为70．27％和76．92％。权威系数为0．855;第二轮指标体系的协调系数为0．486。结论本次研究构成的地方医科大学实验动物管理工作水平评价指标体系是可靠的。     

中国地鼠线粒体DNA 16S rRNA基因序列分析及分子系统发育研究

目的通过克隆分析中国地鼠16S基因的部分序列,对中国地鼠16S基因的结构和功能进行初步探索和揭示。方法从GenBank中已报道的啮齿动物16S基因保守区设计一对引物,进行PCR扩增,测序。用Blastn与GenBank中七种啮齿类动物的16S基因进行序列比较,分析其碱基组成及变异情况,并用邻接法(NJ)、非加权组平均法(UPGMA)构建分子系统树,在分子水平上探讨中国地鼠和其他啮齿类动物的进化关系,对中国地鼠的种属地位进行了进一步验证。结果获得了中国地鼠线粒体16S基因的部分序列,其碱基组成A、T、C、G分别为40.5%、24.5%、18.7%、16.3%,与其他七种啮齿类动物的碱基含量相比,各碱基含量基本相似。NJ进化树表明,中国地鼠、金黄地鼠与欧洲仓鼠先聚为一支,小鼠与大鼠先聚为一支,东方田鼠、台湾田鼠与东欧田鼠先聚为一支。结论中国地鼠和金黄地鼠的亲缘关系最近,与传统的分类地位基本吻合。     

中国地鼠线粒体基因组的序列分析与分子进化

目的 获得中国地鼠线粒体基因组序列,为线粒体疾病模型提供分子数据.方法 参照近缘物种的线粒体基因组序列,设计27对特异引物,采用TD-PCR及测序技术获得了中国地鼠的线粒体全基因组序列,分析了其基因组特点和各基因的定位.还结合GenBank中已发表的其他5种啮齿类动物的线粒体基因组序列,探讨啮齿类动物不同科间的系统进化关系.结果 中国地鼠线粒体基因组全长为16 283 bp,碱基组成为33.53％A、30.50％T、12.98％G、22.80％C,包括13个蛋白质编码基因、2个rRNA基因、22个tRNA基因和1个非编码基因控制区.中国地鼠和金黄地鼠亲缘关系最近.结论 中国地鼠线粒体基因组各基因长度、位置与典型的啮齿类动物相似,其编码蛋白质区域和rRNA基因与其他啮齿类动物具有很高的同源性,显示线粒体基因组在进化上十分保守.5种动物的分子系统进化树与传统分类地位一致.     

山医群体中国地鼠近交E家系RAPD分析

目的　分析山医群体中国地鼠E家系的遗传纯度。方法　应用经过筛选的 3 1条随机引物对中国地鼠E家系 12只个体基因组DNA进行RAPD扩增 ,计算近交个体间的相似系数。结果　所有样品的相似系数0 943 1到 0 9978之间变动 ,平均相似系数为 0 9749,聚类分析得到了这些个体的同源树资料。结论　山医群体E家系有较高的遗传纯度     

Fsp27基因沉默载体的构建及其对细胞脂解的影响研究

构建脂肪特异性蛋白27(Fat-specific protein of 27,Fsp27)基因沉默载体,研究沉默Fsp27基因表达对3T3-L1细胞脂解的影响,并对其作用机制进行探究。采用RNAi技术,构建Fsp27基因真核干扰载体,下调Fsp27基因的表达。“鸡尾酒”法诱导3T3-L1前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞。脂质体转染脂肪细胞,油红O染色脂滴,酶法测定细胞中甘油及甘油三酯的含量。Western blot法检测细胞中Fsp27、HSL、ATGL和PPARγ的蛋白表达。Western blot结果显示:阳性sh-Fsp27干扰载体均能有效下调Fsp27的表达,且伴随细胞内ATGL和PPARγ的表达量升高(P<0.05),其中sh-Fsp27-2的沉默效果最好;酶学方法检测结果显示:阳性sh-Fsp27干扰组细胞中甘油三酯含量下降,甘油含量升高(P<0.05);油红O染色结果发现:空白对照组与阴性对照组均有大脂滴堆积,阳性sh-Fsp27组小脂滴分布广泛,未见明显的大脂滴。sh-Fsp27-2组基因沉默载体的沉默效果最好,Fsp27基因沉默可以加快3T3-L1细胞的脂解速率,其主要是通过抑制脂滴融合和增强ATGL酶的水解来完成对脂解的调控。     

中国地鼠基因组微卫星富集文库的构建与分析

目的筛选中国地鼠微卫星位点,为中国地鼠种质资源的分类、进化等遗传研究奠定基础。方法中国地鼠基因组DNA经超声打碎,用2%琼脂糖凝胶电泳回收500～1000 bp的DNA片段,与SNX连接头连接,连接产物与生物素标记的14种微卫星探针变性及退火,再通过链亲和素偶联磁珠亲和捕捉,经吸附、洗涤及洗脱,然后以洗脱产物为模板,通过PCR扩增,与pGEM-T载体连接,转化大肠杆菌DH10B,构建中国地鼠微卫星DNA富集文库。结果测序结果发现,微卫星DNA序列的阳性克隆占70.3%。结论中国地鼠微卫星文库的建立和微卫星的筛选将为下一步进行中国地鼠遗传连锁图谱的构建、分子进化和系统发育研究提供大量的微卫星标记。     

周脂素在糖尿病肾病大鼠肾组织中的表达

目的观察大鼠糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)模型的特点和尿LN对早期DN的诊断价值,探讨周脂素(perilipin,Plin)在DN大鼠肾脏中的表达情况。方法将14只SD雄性大鼠随机分为对照组(普通饲料)和糖尿病肾病模型组(高糖高脂饲料),对照组6只,模型组8只,饲养4周后模型组按照30mg/kg剂量注射1%链脲佐菌素(STZ),检测血糖≥16.7mmol/L,糖尿病模型制作成功,继续喂养6周,检测24h尿蛋白≥30mg/kg,糖尿病肾病模型制作成功。考马斯亮蓝检测24h尿蛋白、ELISA测尿层粘连蛋白,HE染色观察肾组织的病理变化,Real-time PCR及Western blot检测肾脏组织中perilipin表达情况。结果模型鼠24h尿蛋白≥30mg/kg,糖尿病肾病大鼠模型制作成功。和对照组大鼠相比,模型组的肾重/体重比明显增高(P<0.05),尿量、尿层粘连蛋白于5周出现升高、24h尿蛋白于6周时出现升高,且三项指标均随着时间不断增高。肾组织病理检查显示:肾小球肥大,基膜增生,微小血管瘤形成,肾小管管腔变形,上皮脱落、空泡样变,大量单核、淋巴等炎性细胞浸润,间质内胶原纤维增生。模型组大鼠肾组织Plin的mRNA及蛋白表达均明显的升高(P<0.05)。结论尿层粘连蛋白比24h尿蛋白升高得早,可作为早期糖尿病肾病的警示指标。Plin表达增高可能参与了糖尿病肾病肾病变过程,为进一步探讨糖尿病肾病的发病机制提供新的思路。     

中国地鼠线粒体Cyt b基因测序及其分子进化

目的测定中国地鼠线粒体DNA细胞色素b基因部分序列,分析其分子系统进化关系。方法提取中国地鼠肝脏的总基因组DNA。设计合成特异引物进行PCR扩增,经检测进行测序。用Blast与GenBank中啮齿类其他常用实验动物的物种细胞色素b基因进行同源序列比较,分析其碱基组成及变异情况,并用邻接法、最大简约法、最小进化法构建了分子系统树,在分子水平上探讨中国地鼠和常用啮齿类实验动物的进化关系。结果获得了中国地鼠线粒体Cytb基因的部分序列,共936bp。结论中国地鼠和金黄地鼠的亲缘关系最近,与小鼠、大鼠存在的差异相对大,与豚鼠的亲缘关系最远,与传统的分类地位基本吻合。     

山医群体近交系中国地鼠的G-显带核型和自发畸变率的研究

目的　阐明山医群体近交系中国地鼠G 显带核型和自发畸变率 ,完善中国地鼠的背景资料。方法　采用地鼠骨髓制备和G 显带法。结果　从 14只地鼠的 30个G 显带细胞中 ,7个G 显带细胞被选作模型分析。根据特有带型来识别各号染色体 ,绘制了模式图。此外 ,用常规Giemsa染色分析了 80 0个中期细胞 ,发现染色体断裂为 0 2 5 % ,无着丝粒畸变和不平衡易位均为 0 0 5 % ,自发畸变率很低。结论　山医群体近交系中国地鼠G 显带的识别为结构异常和基因作图提供了科学依据。     

C57BL/6J小鼠脂肪组织总RNA提取及周脂素基因的克隆

目的用改进后的方法提取高质量的RNA,以此为模板,应用T-A克隆法克隆C57BL/6J小鼠周脂素基因编码区,对其进行测序验证,并与GenBank比对。方法在试剂说明书基础上,改进提取脂肪组织RNA的方法,从C57BL/6J附睾脂肪组织提取高质量的总RNA,用RT-PCR扩增出周脂素编码区基因,并将目的基因编码区克隆入pMD18-T载体中,转化E.coli JM109后,筛选阳性克隆,通过限制性内切酶酶切鉴定后,对其进行测序验证,并与GenBank比对。结果用改进后的方法成功提取出了高质量的总RNA,并且成功提取构建的重组载体中含有周脂素基因的全长序列,与GenBank公布的序列一致。结论改进的后的脂肪组织RNA提取方法是可行的,并获得周脂素基因的cDNA,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。