日本血吸虫信号转导蛋白Sjwnt_4基因的克隆、表达及功能分析

由Wnt基因家族产物与其它相关基因产物构成的Wnt信号通路,是细胞发育和生长调节的一个关键途径,对动物的发育特别是生殖系统的发育起重要的调节作用。在人类和小鼠中,Wnt4蛋白是性腺分化过程中主要调节因子,在胚胎发育中起着关键作用。利用RACE技术从日本血吸虫19d童虫中首次扩增到一个Wnt家族基因,序列分析表明该基因的完整编码框含1311bp,编码436个氨基酸,理论分子量49.6kD。同源性分析结果表明,该基因的氨基酸序列具有典型Wnt家族蛋白特征,与日本三角涡虫、人Wnt4的氨基酸序列相似性分别达43％、37％,推测为血吸虫的Wnt4基因,命名为Sjwnt4（GenBank登陆号DQ643829）。实时定量PCR分析显示该基因在14d童虫、19d童虫、31d虫体、44d雌虫及44d雄虫中均有表达,其中19d童虫中的表达量明显高于其它发育阶段,44d雌虫中的表达量明显高于雄虫。构建了该基因的原核表达载体pGEX_4T_2_Sjwnt4,应用大肠杆菌系统进行了表达,表达蛋白以包涵体形式存在,Western印迹显示表达产物能被日本血吸虫成虫粗抗原免疫血清所识别。Sjwnt4基因及其表达产物的获得,为探索Wnt信号通路对血吸虫发育、生殖的调节提供了重要基础。     

甲烷氧化细菌氧化活性影响因素的研究

分别对土壤含水量、温度、施肥措施、土壤中CO_2和O_2含量等几个影响甲烷氧化细菌氧化活性的因素作一综述,分析其原因,为今后进一步研究奠定基础。     

日本血吸虫期别差异表达基因文库的构建及分析

为从期别差异表达基因分析入手研究血吸虫的生长发育机制,应用抑制性消减杂交 (suppressed subtractive hybridization , SSH) 技术首次构建了日本血吸虫尾蚴、虫卵和成虫的期别差异表达基因文库 . 经消减效率分析和三种文库克隆的 EST 的期别差异性鉴定,表明所建文库质量较高,为在整个基因组水平分离血吸虫的差异表达基因提供了重要材料 . 由三个文库选择 257 个插入片段大于 500 bp 的克隆测定了 EST 序列 . 同源性分析结果表明 257 个 EST 代表 182 种血吸虫基因,其中有 22 种为血吸虫已知基因,有 128 种为血吸虫已知 EST ,有 32 种为新发现的血吸虫基因 . 对 EST 编码蛋白的功能预测结果显示：尾蚴消减文库的基因多与运动、能量代谢、转录调节及致病性相关;虫卵消减文库的基因可能参与信号转导、细胞粘附、蛋白质和碳水化合物的代谢以及抗氧化反应;成虫消减文库的基因多参与蛋白质的合成、转运及分解代谢,参与虫体的运动等 . 大规模分离、分析血吸虫期别差异表达基因将对从分子水平去解读血吸虫的生长发育机制,筛选高效疫苗候选抗原、药物靶标及诊断制剂有重要意义 .     

日本血吸虫Sj Cyclophilin B基因的克隆、表达及免疫保护效果分析

本研究克隆和表达了日本血吸虫Cyclophilin B(Sj CyPB)编码基因的cDNA,分析其在日本血吸虫不同发育阶段虫体的表达情况,评估该重组抗原在小鼠体内诱导的抗血吸虫免疫保护效果。本研究以日本血吸虫童虫cDNA为模板,RT-PCR扩增其基因全长cDNA,提交序列到NCBI,登录号为GQ403665。荧光实时定量PCR分析该基因在日本血吸虫不同发育阶段虫体的表达情况,构建重组表达质粒,表达纯化重组蛋白。利用Western blotting检测重组蛋白的抗原性。以重组抗原免疫小鼠,评估其对小鼠诱导的免疫保护效果。结果表明,RT-PCR获得了Sj CyPB编码基因的全长cDNA,其开放阅读框为672bp。经分析确定其为CyPs家族中的CyPB基因,命名为Sj CyPB。荧光实时定量PCR分析表明,该基因在18d童虫期表达量最高,32d次之。构建了重组表达质粒pGEX-6P-1-SjCyPB,并在大肠杆菌中成功表达,表达产物分子量为49.5kDa。Western blotting试验显示该重组蛋白具有良好的抗原性,在小鼠免疫试验中,与空白对照组比较,免疫组小鼠获得31.5%的减虫率和41.01%的肝脏减卵率。本研究获得了日本血吸虫童虫期高表达的Sj CyPB基因的全长cDNA,成功构建了Sj CyPB原核重组表达质粒,并在大肠杆菌中成功表达,证实该重组抗原在小鼠体内诱导产生了部分免疫保护效果。     

双季稻田冬季种植模式对土壤有机碳和碳库管理指数的影响

为探讨冬季覆盖作物还田对稻田土壤碳库的影响,通过冬季种植油菜、紫云英、黑麦草、马铃薯,并以冬闲为对照进行大田试验,测定了不同冬季作物模式下早稻和晚稻的土壤有机碳、活性有机碳含量,并计算了稳态碳、碳库活度、活度指数、碳库指数和土壤碳库管理指数.结果表明:冬季作物还田增加了土壤有机碳含量,早稻和晚稻后的土壤有机碳含量比对照分别提高了1%～8%和3%～18%;油菜、黑麦草和紫云英还田均促进了土壤活性有机碳含量的增加,早稻后增加16.2%～84.2%,晚稻后增加24.4%～28.1%;冬季作物还田增加了土壤碳库管理指数,增加幅度为1.4%～41.8%.综上所述,冬种作物还田有利于提高土壤的固碳效应,并提升土壤质量,以种植黑麦草、紫云英的综合效果较佳.     

日本血吸虫SjIrV1的基因特性及免疫保护效果

钙结合蛋白是日本血吸虫生长发育不可缺少的蛋白,具有非常广泛而重要的功能.在课题组日本血吸虫体被表膜蛋白研究基础上,利用PCR技术克隆了中国大陆株日本血吸虫66 kDa钙结合蛋白(SjIrV1)编码基因的cDNA序列,BLAST分析与菲律宾株日本血吸虫SjIrV1 cDNA编码序列一致,荧光定量PCR分析表明该基因在童虫和成虫期不同发育阶段均有表达,其中在35d和42d成虫中表达量较高,在42d雌虫中该基因表达水平远高于42d雄虫.构建重组表达质粒pET28a(+)-SjIrV1,在大肠杆菌中成功诱导表达,重组蛋白主要以可溶性形式存在,通过高效液相色谱法(RP-HPLC)以及串联质谱法(MS/MS)鉴定所获蛋白为目的蛋白SjIrV1.蛋白质印迹(Western blotting)分析结果显示重组蛋白能被感染日本血吸虫鼠血清和免疫鼠血清所识别,SjIrV1蛋白在虫体各发育阶段中均表达.免疫荧光染色实验观察表明SjIrV1主要分布在日本血吸虫成虫的表膜.应用重组蛋白免疫BALB/c小鼠后,免疫鼠血清中检测到较高水平的特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体.结果表明SjIrV1可能在日本血吸虫的生长发育过程中起着重要作用.     

日本血吸虫中国大陆株21.7kD蛋白编码基因的克隆和表达

根据日本血吸虫菲律宾株编码21.7kD蛋白的基因设计引物,以日本血吸虫中国大陆株成虫mRNA为模板,用RT-PCR法扩增出大小为558bp的基因片段。经序列分析推断该基因片段为编码日本血吸虫中国大陆株21.7kD蛋白基因的完整阅读框,与菲律宾株该基因的碱基序列同源性为98%。将其克隆到表达载体pET28a(+)中,在大肠杆菌BL21中获得表达,融合表达产物分子量约为25.4kD。利用日本血吸虫成虫抗原免疫血清对该表达产物进行Western印迹检测,在预测位置出现了明显的识别条带,说明该基因的表达产物具有抗原性。     

日本血吸虫凋亡基因Sjcaspase3的克隆、真核表达 及其功能分析

为深入研究日本血吸虫细胞凋亡机制。利用PCR技术扩增得到Sjcaspase3的全长序列,其ORF含900 bp,编码299个氨基酸,理论分子量为33 509.7 Da,理论等电点为6.39。Real-time PCR分析表明该基因在日本血吸虫生长发育的各个时期均有表达,其中21 d表达量最高,42 d雌虫表达量高于42 d雄虫。成功构建了p XJ40-FLAG-Sjcaspase3重组质粒并转染到Hela细胞内,荧光定量PCR和Western blotting分析表明Sjcaspase3成功在Hela细胞中表达。酶活分析提示重组Sjcaspase3具有切割特异性底物天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸(DEVD)的活性。流式细胞术检测了Sjcaspase3可诱导Hela细胞发生早期细胞凋亡。研究结果为深入探讨Sjcaspase3的生物学功能及日本血吸虫细胞凋亡机制奠定了基础。     

节水轻简栽培模式下增密减氮对双季稻田温室气体排放的影响

为了明确节水轻简栽培模式下增密减氮对双季稻田温室气体排放的影响,以陆两优996(早稻)和丰源优299(晚稻)为材料,使用密闭静态箱法收集温室气体,监测早晚稻不同增密减氮组合CH₄和N₂O的排放动态,探讨不同增密减氮措施对早晚稻田CH₄和N₂O的累积排放量、全球增温潜势(GWP)、排放强度(GHGI)的影响。结果表明: 不同增密减氮组合间的CH₄、N₂O累积排放量差异显著。与对照(CK)相比,增密减氮组合IR₂(早稻施氮量为86.4 kg·hm^-2,密度为36万穴·hm^-2;晚稻施氮量为108 kg·hm^-2,密度为32万穴·hm^-2)的CH₄累积排放量、GWP、GHGI两季平均分别降低了50.8%、37.3%、42.9%;早稻IR₂的N₂O累积排放量最低,降低了33.7%,晚稻以IR₁(早稻施氮量为103.2 kg·hm^-2,密度为32万穴·hm^-2;晚稻施氮量为129 kg·hm^-2,密度为28万穴·hm^-2)的N₂O累积排放量最低,降低了94.9%;稻田周年温室效应(总GWP、GHGI)仍以IR₂最低。与其他增密减氮处理相比,早晚氮肥均减少28.0%、早稻密度增加28.6%、晚稻密度增加33.3%(IR₂)既可保证高产,又可减少温室气体排放。     

日本血吸虫童虫裂解物对东方田鼠肝脏T7噬菌体展示cDNA文库的筛选及阳性克隆分析

东方田鼠对血吸虫具有天然抗性。为筛选和分析东方田鼠抗血吸虫抗性相关基因, 以日本血吸虫童虫可溶性裂解物为探针, 筛选东方田鼠肝脏噬菌体展示cDNA文库。经三轮筛选, 特异性噬菌体得到有效富集(375倍)。随机挑取92个克隆进行序列测定, 获得了19条有效EST序列。其中13个条EST序列与已知基因或表达序列标签同源, 6个EST序列与已知基因或表达序列标签均无同源性, 为新的表达序列标签。将19个EST序列的阳性噬菌体克隆和血吸虫童虫共培养, 其中4号(GenBank Accession No.: EW968294)、13号(GenBank Accession No.: EW968303)、14号(GenBank Accession No.: EW968304)、15号(GenBank Accession No.: EW968305)、18号(GenBank Accession No.: EW968308)克隆均诱导了显著的杀虫效果。综合生物信息学分析结果及体外杀伤试验结果, 编码CASP8和FADD类似性细胞程序性死亡调节蛋白、a-2-HS-糖蛋白、M4蛋白、具有R3H结构域的一种mRNA结合蛋白以及三种未知蛋白的编码基因(14、15、18号克隆)可能是东方田鼠抗血吸虫病抗性相关基因。为进一步研究东方田鼠抗血吸虫机理奠定了基础。