杜氏盐藻叶绿体atpA基因片段的克隆及序列分析

根据莱因衣藻、卵形肾藻、普通小球藻等10种藻类的atpA全基因氨基酸高度保守序列,设计简并引物,利用PCR方法从盐藻叶绿体DNA中扩增出约400bp的片段,将该片段连接到T-vector上进行序列测定。结果表明,核苷酸长度为405bp,编码135个氨基酸。推导的氨基酸序列与莱因衣藻的同源性为92%,普通小球藻88%,Mesostigmaviride87%,卵形肾藻86%,Cyanidioschyzonmerolae85%。以所克隆的DNA片段为探针,与盐藻叶绿体基因组进行SouthernBlot杂交结果有明显的杂交信号。据此可推断本实验中所克隆的序列为杜氏盐藻叶绿体atpA基因片段。该基因序列已被GenBank收录,接受号为AY435096。     

杜氏盐藻psaB基因cDNA的克隆与序列分析

根据真核生物莱茵衣藻(Chlamydornonas reinhardtii)、Chlamydomonas moewusii、Chlorella vulgaris以及Mesostigma viride的psaB基因的氨基酸高度保守序列,设计一对简并引物,利用TRIzol试剂提取杜氏盐藻(Dunaliella salina)细胞的总RNA,通过RTPCR,得到的一段长为1．8kb左右的cDNA片段。PCR产物经T-A克隆并测序分析以及测序结果推导成氨基酸序列进行同源性比较．表明所克隆的1815bp序列为杜氏盐藻psaB cDNA片段,GenBank收录号为AY820754。根据已经得到的psaB序列推导成氨基酸序列与一些已知物种的psaB基因相比较,同源性分别为Chlamydomonas reinhardtii 92％,Chlamydornonas moewusii 91％,Chlorella vulgaris 86％,Mesostigma viride 85％,Physcomitrella patens subsp．Patens 85％,Nephroselmis olivacea 84％。据此可推断本实验中所克隆的序列为杜氏盐藻psaB cDNA序列.     

杜氏盐藻随机MAR文库的构建

核基质附着区(Matrixattachmentregion,MAR)是一段与核基质结合的DNA序列。为分离杜氏盐藻核基质附着区,我们首次构建了杜氏盐藻MAR文库。首先用0.5%TritonX-100裂解细胞,经30%和70%Percoll不连续梯度离心分离盐藻细胞核,再用二碘水杨酸锂(lithiumdiiodosalicy-late,LIS)去除组蛋白和限制酶消化除去结合松弛的DNA片段,最后通过蛋白酶K消化和乙醇沉淀提取盐藻核基质DNA。采用4种限制酶酶切,T_4DNA连接酶连至用相应限制酶酶切的pUC18载体上,转化E.coliJM109感受态细胞,挑选阳性克隆,构建MAR文库。部分测序分析表明,克隆的DNA片段具有明显的MAR特征。为进一步研究MAR对基因表达的调控作用及其作用机制提供了基础。     

小鼠canstatin及其N端片段在大肠杆菌BL21 中的表达

以小鼠肝脏组织总RNA为模板,通过RT-PCR扩增小鼠canstatin及其N端片段基因,克隆到pMD18-T载体中并进行序列分析。将小鼠canstatin及其N端片段基因定向克隆于原核表达载体pET30a(+)中,分别构建表达质粒pET/Can和pET/Can-N, 转化大肠杆菌BL21(DE3), IPTG诱导表达。结果表明: 小鼠canstatin的cDNA长度为684bp,编码227个氨基酸,与已知的人canstatin cDNA同源性为89%,氨基酸的同源性为96%。小鼠canstatin N端片段(1-95aa)与人的同源性为100%。 IPTG诱导原核表达载体pET/Can和pET/Can-N在大肠杆菌 BL21(DE3)中的表达量约占菌体总蛋白量的35% 和 18%, 重组蛋白主要以包涵体形式存在。文中报道的小鼠canstatin 及其N端片段核苷酸序列已收入GenBank, 接受号分别为: AY375463和AY502946。Abstract:The mouse canstatin and its N-domain cDNA were amplified from total RNA of mouse liver by RT- PCR and cloned into vector pMD18-T for sequencing. Prokaryotic expression vectors pET/Can and pET/Can-N were constructed and expressed in E.coli BL21(DE3) with induction of IPTG.. Mouse canstatin cDNA is 684bp in length encoding 227 amino acids. The sequences of both cDNA and amino acids share high homology with human canstatin, with cDNA identity at 89% and amino acids identity at 96% to human canstatin. N-domain of mouse canstatin is the same amino acid sequence as that of human canstatin. In the present study, prokaryotic expression vector pET/Can and pET/Can-N were expressed in E.coli BL21 with amount of 35% and 18% of the total bacterial proteins after being induced by IPTG for 4h. The expressed products existed mainly as inclusion bodies. This work has laid down the basis for further study of its angiogenic activity and potential application for tumor dormancy therapy.     

杜氏盐藻随机MAR文库的构建

核基质附着区(Matrix attachment region,MAR)是一段与核基质结合的DNA序列。为分离杜氏盐藻核基质附着区,我们首次构建了杜氏盐藻MAR文库。首先用0．5％ Triton X-100裂解细胞,经30％和70％ Percoll不连续梯度离心分离盐藻细胞核,再用二碘水杨酸锂(lithium diiodosalicylate,LIS)去除组蛋白和限制酶消化除去结合松弛的DNA片段,最后通过蛋白酶K消化和乙醇沉淀提取盐藻核基质DNA。采用4种限制酶酶切,T4DNA连接酶连至用相应限制酶酶切的pUC18载体上,转化E．coli JM109感受态细胞,挑选阳性克隆,构建MAR文库。部分测序分析表明,克隆的DNA片段具有明显的MAR特征.为进一步研究MAR对基因表达的调控作用及其作用机制提供了基础。     

杜氏盐藻两种碳酸酐酶基因启动子的克隆和功能研究

将克隆得到的杜氏盐藻DCA7和CA基因的启动子区与bar基因和NOS polyA终止子片段融合,分别构建成pMDDC-B和pMDC-B转基因杜氏盐藻表达载体。用基因枪法将两种表达载体转化人杜氏盐藻细胞,通过除草剂草丁膦筛选培养获得转化藻株,对转化藻株进行分析。对转化杜氏盐藻藻株的筛选培养结果表明：pMDDC-B和pMDC-B载体中的外源bar基因能在杜氏盐藻细胞中稳定或瞬时表达。同时在氦气压力为690kPa条件下,微弹轰击2次比微弹轰击1次或3次的效果更好。对pMDDC-B转化杜氏盐藻得到的稳定表达的转化藻株进行的PCR和Southern印迹分析的结果表明：外源的bar基因确已整合到杜氏盐藻基因组中。Northern印迹分析表明：DCA7基因启动子驱动bar基因在杜氏盐藻细胞中的表达效率受氯化钠浓度梯度调控。推测首次克隆得到的DCA7基因启动子可能是一种活性高、安全性好的高渗诱导性启动子;杜氏盐藻DCA7和CA基因启动子区的GT高度重复序列,可能与杜氏盐藻高度耐盐的分子机制有关。