伪狂犬病病毒TK-/gG-缺失株的构建及其生物学特性研究

将伪狂犬病病毒TK^-／gG^-／LacZ^ 突变株的基因组DNA与含有缺失的gG基因的转移质粒pUSKBB共转染猪肾传代细胞PK-15,待完全病变后收获病毒进行空斑试验,用PCR筛选gG缺失的重组病毒。空斑纯化3次后,随机挑取空斑进行PCR扩增,证实所获得的病毒为均一的TK^-／gG^-缺失株。遗传稳定性试验表明该重组病毒能在PK-15细胞上稳定遗传,动物试验表明该缺失株对Balb／c小鼠极为安全且能保护Balb／c小鼠抵抗致死量PRV强毒的攻击。该突变株的获得为我国伪狂犬病的控制和根除奠定了基础。     

猪胸膜肺炎放线杆菌flic蛋白二级结构与B细胞表位预测

目的:预测和分析猪胸膜肺炎放线杆菌(Actionobacillus pleuropneumoniae,APP)鞭毛蛋白(flic)的二级结构和B细胞表位.方法:利用生物信息学方法对flic基因推导的氨基酸序列进行结构特征和B细胞表位预测分析.结果:flic蛋白为非稳定型脂蛋白,含有2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点(39-42 SirD,164-167 SvkD)和3个蛋白质激酶C磷酸化位点(39-41 SiR,161-163 TsR、164-166 SvK).该蛋白无信号肽,在21Ala～38Ala处存在跨膜区的可能性最大.fljc蛋白的二级结构主要由无规卷曲区域、α-螺旋和β-折叠组成,而形成较少的转角结构.该蛋白的B细胞表位可能位于55～61和152～158区段内或其附近区域.结论:预测结果将有助于确定file蛋白的B细胞表位,为进一步研究flic基因功能及研制APP基因工程疫苗提供参考.     

胸膜肺炎放线杆菌RTX毒素与宿主的相互作用

摘要：胸膜肺炎放线杆菌引起猪传染性胸膜肺炎,给养猪业造成严重的经济损失。RTX毒素是胸膜肺炎放线杆菌主要的毒力因子,在该病原的感染与免疫中发挥“双刃剑”的作用。本文综述了近十多年来国内外在胸膜肺炎放线杆菌RTX毒素的研究进展,提出了毒素与宿主互作研究的必要性和技术可行性,认为毒素与宿主相互作用研究将诠释此病原的分子致病机理。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素apxH基因无药物抗性标记突变株HBC-/GFP+的构建及其生物学特性研究

通过使用枯草芽胞杆菌一个蔗糖敏感sacB基因发展了一种依靠蔗糖的负向筛选系统,这种方法允许没有标记突变的基因进入胸膜肺炎放线杆菌染色体。首先,构建了猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素apxⅡ基因GFP插入失活型的重组质粒pOSAKCG,其中一个表达盒含有氨苄青霉素基因和以外膜蛋白omlA作为启动子表达sacB基因。重组质粒pOSAKCG通过电穿孔转化,它的突变apxⅡCA基因与野生型亲本菌株胸膜肺炎放线杆菌HB03染色体上野生型apxⅡCA基因发生同源交换,两步法筛选获得了apxⅡ基因突变株HBC^-／GFP^ ,PCR和Southern blot对突变株进行初步鉴定,进一步对突变株的一些生物学特性,包括它的溶血活性、免疫原性、生长特性及其对小鼠的安全性进行了研究。结果表明,无药物抗性标记突变株的构建是成功的。该突变株的构建为进一步研究突变株作为载体和疫苗奠定了坚实的基础。     

伪狂犬病病毒gE基因主要抗原表位区在大肠杆菌中的表达与gE乳胶凝集鉴别诊断方法的建立

将伪狂犬病病毒(PRV)Ea株gE基因主要抗原表位区段融合到原核表达载体pET28b的T7启动子下游,构建成原核表达质粒,经IPTG诱导,SDS-PAGE和Western blot印迹分析,证实gE基因主要抗原表位区在大肠杆菌中获得了表达,表达产物具有抗原性,分子量为38kD,位于包涵体中.包涵体经变性、复性处理,复性产物致敏乳胶,并对抗原致敏浓度、致敏时间、致敏温度进行优化,建立了gE乳胶凝集试验(gE-LAT).该方法不仅能显著区分gE基因缺失疫苗免疫猪血清和野毒感染猪血清,而且具有简便、快速等优点.检测临床360份猪血清,阳性率为57.78%(208/360),比国外阻断gE-ELISA的58.06%(209/360)略低,阳性符合率为94.86%(203/214),总符合率为96.94%(349/360),两种检测方法结果差异不显著(P＞0.05).     

口蹄疫病毒单克隆抗体的制备及检测应用

用纯化的口蹄疫病毒(Footandmouthdiseasevirus,FMDV)免疫BALB/C小鼠,将免疫鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,采用有限稀释法进行克隆,经筛选获得多株能稳定分泌抗FMDV单抗的杂交瘤细胞株。选择其中一株(2G12)用于下列实验,其细胞培养上清液的效价是1:256,腹水效价是1:1280;以自行制备的兔抗FMDV高免血清IgG为捕获抗体包被酶联免疫吸附试验微量反应板,以单抗2G12为第二抗体,建立了快速检测FMDV抗原的双抗体夹心ELISA,该方法能检出90ng病毒,而且只与FMDV发生特异性反应,与猪瘟病毒(HCV)、猪蓝耳病病毒(PRRSV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和乙脑病毒(JEV)均不发生反应。本研究为检测口蹄疫病毒抗原提供了灵敏和特异的方法。     

伪狂犬病病毒gE基因在昆虫细胞中的高效表达

伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)属疱疹病毒科α-疱疹病毒亚科,能引起多种家畜及野生动物的伪狂犬病,尤其是猪的伪狂犬病,已成为危害当今养猪业的最严重的传染病之一[1].由于伪狂犬病病毒具有极强的潜伏感染特性和神经嗜性[2-3],80年代以前一直以为伪狂犬病无法根除.随着现代生物技术的发展,尤其是基因工程缺失标记疫苗和单克隆抗体技术的诞生与应用,才使该病的根除成为可能.     

乙型脑炎病毒sA14-14-2株NS1基因片段的克隆、测序与表达

以流行性乙型脑炎病毒减弱毒株SA14－14－2的基因组RNA为模板,采用RT－PCR技术扩增其NS1基因的cDNA,将其克隆到pMD18-T载体中,得到克隆质粒pMD18-T-NS1.pMD18-T-NS1经EcoRI和SalI酶切后,回收NS1片段克隆到原核表达载体pET-28a( )EcoRI/SalI位点,构建了重组原核表达质粒pET-28a（＋）－NS1。转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导诱导获得高效表达。产物经SDS－PAGE电泳结果显示,表达产物分子量约为45kD。Western blotting分析表明产物具有抗原活性。     

猪β防御素2成熟肽在酵母中的表达

【目的】将猪β防御素2成熟肽基因片段正确整合到酵母基因组染色体上,从而得到稳定的猪β防御素2成熟肽的毕赤酵母表达株。实现猪β防御素2成熟肽的表达。【方法】首先参考酵母偏爱密码子,设计3段引物序列,利用PCR技术扩增得到β防御2成熟肽基因,构建了重组质粒pPIC9k-GST-pBD-2和pPIC9k-pBD-2。将线性化的重组质粒电转化到毕赤酵母KM71细胞中。最后筛选得到酵母阳性克隆,通过不断调节表达条件,实现猪β防御素2成熟肽的表达。【结果】将GST-pBD-2基因序列和pBD-2基因序列分别成功整合到酵母KM71基因组中,重组毕赤酵母工程菌构建成功;重组酵母蛋白GST-pBD-2和PBD-2都成功获得了表达;PBD-2成熟肽表达上清对猪霍乱沙门氏菌弱毒株C500有一定的抑制作用。【结论】获得表达pBD-2成熟肽的酵母菌株,本实验是用真核细胞表达pBD-2成熟肽的一次探索,为后续大量表达pBD-2成熟肽方法的研究打下了基础。