RNase P核酶对人巨细胞病毒UL54基因mRNA体外切割作用

外部引导序列(EGSs)是mRNA靶序列互补并引导RNase P切割的小RNA片段.我们设计与人巨细胞病毒HCMV(Human Cytomegalovirus) UL54基因mRNA序列互补的EGSs,将其与大肠杆菌来源RNase P催化核心M1 RNA构建成M1GS核酶.通过对UL54基因亚克隆片转录产物体外切割研究,证实该核酶具备对UL54 mRNA片段的特异切割能力,可以发展成为一种抗病毒试剂.     

核酶对人巨细胞病毒mRNA片段的体外切割

引导序列GSs(GuideSequences)是能与mRNA互补,引导核酶RNaseP催化核心M1RNA对互补区域特异切割的小片段游离RNA。针对人巨细胞病毒HCMV(humancytomegalovirus)DNA聚合酶mRNA序列设计GS,共价结合到大肠杆菌来源M1RNA中,构建成M1GST7核酶。通过对巨细胞病毒DNA聚合酶亚克隆片段转录产物体外切割实验,表明该核酶具备对DNA聚合酶mRNA片段的特异切割能力 。     

RNase P核酶对人巨细胞病毒UL54基因mRNA体外切割作用

外部引导序列(EGSs)是mRNA靶序列互补并引导RNaseP切割的小RNA片段。我们设计与人巨细胞病毒HCMV(Human Cytomegalovirus)UL54基因mRNA序列互补的EGSs,将其与大肠杆菌来源RNaseP催化核心M1RNA构建成M1GS核酶。通过对UL54基因亚克降片转录产物体外切割研究,证实该核酶具备对UL54 mRNA片段的特异切割能力,可以发展成为一种抗病毒试剂。     

HCMV UL97 mRNA序列特异性M1GS的构建及其体外切割活性研究

HCMV UL97基因编码一种蛋白激酶,该酶参与调控病毒DNA的复制和衣壳的形成,且序列异常保守,可作为抗HCMV治疗的重要靶位。基于HCMV UL97 mRNA T3位点附近的序列,设计一段与该位点互补的引导序列（Guide Sequence,GS）,并将其与大肠杆菌核酶P催化亚基（M1 RNA）的3’末端共价连接,构建了一种序列特异性的M1GS（M1-T3）。体外实验证实,所构建的M1-T3可与UL97 mRNA的T3位点特异性结合并产生有效的切割作用。进一步研究M1-T3的结构与其对底物片段靶向切割活性的关系,结果发现在M1 RNA与GS之间增加一段88核苷酸桥连序列的M1-T3（即M1-T3’）,其靶向切割活性大大增强。此外,去除M1-T3 3’末端的CCA序列,其靶向切割活性将基本丧失。上述结果表明,这段桥连序列和3’末端的CCA序列是M1-T3重要的结构元件。这不仅有助于阐明M1GS与其底物的相互作用机制,同时也为进一步评价M1-T3在体内对UL97基因表达及病毒复制的抑制活性奠定了基础。     

工程菌BL21-PET21a(+)-phyA表达植酸酶的研究

对来源于Aspergillusniger的植酸酶基因phyA进行了改造 ,去除了内含子和信号肽编码序列后重组到表达载体PET2 1a( )上 ,导入大肠杆菌BL2 1 (DE3)中 ,构建工程菌株BL2 1 PET2 1a( ) phyA。植酸酶基因在工程菌株中得到了高效表达。表达产物主要以包涵体形式存在 ,表达量达到菌体蛋白的 30 %以上。改进了包涵体复性技术 ,包涵体蛋白经复性、纯化后 ,生物活性达到 1 5 0 0U mg ,并且复性蛋白具有较好的热稳定性 ,经过 75～ 95℃、30min的热处理后 ,仍然保持了生物活性 ,同时有明显的热激活现象。热激活后最高生物活性达到 5 0 0 0U mg。这一发现对于植酸酶的应用研究具有一定的意义