结核分枝杆菌功能基因组研究的方法学

DNA芯片、基因中断、基因互补法、差示荧光诱导法、生物信息学、蛋白质组、DNA库免疫、细菌人工染色体库是结核分枝杆菌研究的主要方法。综合利用上述技术可能是我们开展结核分枝杆菌功能基因组学研究的最佳切入点。     

非离子型去垢剂Triton X—114提取两歧双歧杆菌的脂磷壁酸

本研究利用非离子型去垢剂Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４提取两歧双歧杆菌细胞壁的脂磷壁酸（ＬＴＡ）,ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｃｅｌ阴离子层垢后,Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４与ＬＴＡ分开为两个峰,收集ＬＴＡ洗脱峰,经紫外扫描、化学组分分析证实提取的ＬＴＡ无明显蛋白质、核酸污染。被动血球凝集试验结果显示,ＬＴＡ能自主粘附绵羊红血球,并能同抗ＬＴＡ抗体或抗两歧双歧杆菌抗体结合而使血球凝集。我们采用的方法是分离细胞壁ＬＴ     

渗透胁迫对杜氏盐藻胞内甘油含量及相关酶活性影响

杜氏盐藻(Dunaliella salina)是一种抗渗透能力强的单细胞绿藻, 甘油在其渗透调节过程中发挥重要作用。本实验对5种不同NaCl浓度条件下, 盐藻的生长、细胞内甘油含量及甘油代谢相关酶的活性变化进行了测定。结果表明, NaCl浓度过高或过低均影响盐藻的生长; 高渗胁迫条件下甘油含量迅速增加,3-磷酸甘油磷酸酶的活性和二羟丙酮还原酶催化二羟丙酮转化为甘油的活性明显增加; 而低渗胁迫条件下的甘油含量会迅速降低, 3-磷酸甘油磷酸酶的活性丧失, 二羟丙酮还原酶催化甘油转化为二羟丙酮的活性增加。基于此实验结果, 我们对盐藻渗透胁迫条件下细胞内的甘油代谢过程与其抗渗透胁迫能力的相关性进行了探讨。     

异烟肼耐药结核分枝杆菌感染人源巨噬细胞的蛋白质组学研究

利用双向电泳技术,对人源巨噬细胞U937感染异烟肼耐药结核分枝杆菌前后的全细胞蛋白表达图谱进行差异比较和分析,发现其中产生差异的有32个蛋白质斑点,利用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱技术,对其中5个表达明显上调的蛋白质斑点进行分析鉴定,获得5个明确的肽质量指纹图谱,通过在数据库中进行检索分析,确定这5个蛋白质分别为热休克蛋白105_β、凋亡抑制蛋白-1、磷酸甘油酸变位酶1、组织蛋白酶B、桥粒胶蛋白3.上述发现有助于了解耐药结核分枝杆菌入侵早期导致的巨噬细胞蛋白质组表达变化,为深入研究耐药结核分枝杆菌-宿主相互作用提供了探索方向.     

寡核苷酸芯片研究结核分枝杆菌临床株和无毒株诱导的巨噬细胞U937凋亡相关基因的差异表达

结核病仍然是人类健康的主要威胁,结核分枝杆菌诱导的巨噬细胞凋亡是宿主防御反应之一,研究凋亡相关基因的差异表达有助于认识结核分枝杆菌致病机理和发现新的药物靶标。利用包括19200个基因或基因片段的DNA芯片研究巨噬细胞株U937对临床和实验室菌株感染的差异表达,Northem blotting和RT—PCR验证了芯片研究结果。Mtb H37Rv感染下调bcl—2,vitaminD受体、干扰素调控因子3、细胞色素氧化酶C表达,幅度分别为2-,3-,3-,2．5-倍,临床菌株感染上调SOD2、SOD3、丝氨酸蛋白酶、toll—like受体2、signal transducer and activator(STAT1)、hypoxia—inducible factor22等表达,幅度分别为2．9-,2．5-,2．5-,22-,2．4-,5．9-倍。结果提示,临床菌株感染更多促进凋亡,限制宿主的杀灭机理。该研究为进一步研究导致这些差异表达的结核分枝杆菌成分提供了基础。     

后基因组时代的结核新疫苗研究

利用蛋白质组技术、生物信息学的DNA芯片等技术筛选适当的保护性抗原,重点在亚单位疫苗的DNA疫苗方面构建预防性和治疗性的疫苗,并配合使用亚单位疫苗,DNA疫苗和减毒活疫苗是值得重视的方向。     

寻找微生物基因组中适合高通量药物筛选靶点的功能未知基因

开发有新作用机制的抗生素迫在眉睫。刚发现青霉素时 ,几乎所有的金黄色链球菌都是药物敏感型 ;异烟肼和链霉素刚用来治疗结核病时 ,效果几乎 1 0 0 % ,但 90年代中期 ,几乎 90 %的金黄色链球菌和 50 %以上的结核分枝杆菌都耐药 ,耐多药菌株也日益普遍。现有抗生素的作用机制比较单一 ,是细菌产生耐药性的一个主要原因。解决日益严重的细菌耐药性、交叉耐药性、毒性和难以根除条件致病菌感染最有效的途径是开发新作用机制的抗生素。1 .微生物基因组及其功能未知基因中蕴涵了开发新型抗生素的大量有用靶点抗生素开发首先往往需要鉴定靶点。靶…     

细菌的耐药性和生物武器的防御

抗生素在人类同疾病斗争中发挥重要作用,其作用机制是它作用于微生物的某一代谢环节。抗菌药物的长期使用使得细菌耐药性不断出现,细菌某些基因突变是产生耐药性的主要原因。本文还介绍了生物武器防御问题,重点效应在利用微生物基因组研究成果上。     

结核分枝杆菌入侵诱导的人巨噬细胞全局性基因表达变化

利用含有12800个基因全长或部分序列的基因芯片研究结核分枝杆菌无毒株入侵导致的人巨噬细胞U937全基因组在转录水平的表达谱变化. 结果表明其中473个基因(3.7%)差异表达, 表达上调的基因25个(5.3%), 上调超过3倍的包括丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶, 可溶性结合半乳糖苷的凝集素, 蛋白质酪氨酸磷酸酶delta, DDR受体酪氨酸激酶等的编码基因, 其余基因(94.7%)表达下调. 表达下调的基因中, 表达仅为原来1/3以下的25个, 其中syndecan 结合蛋白的表达下调12.5倍. 芯片研究结果与结核分枝杆菌一般抑制宿主细胞免疫应答的趋势相符. 这473个基因中的376个基因在GenBank中有记录, 另外97个是新基因. 生物信息学分析提示差异表达基因编码产物与细胞内信号传导、细胞因子反应、细胞骨架重建、细胞凋亡、铁代谢、电子传递、线粒体功能和离子通道等有关. 这些差异表达基因中, 有17个是文献报道过的, 而且都印证了本文的结果. RT-PCR和Northern杂交实验确证了表达谱芯片研究结果. 通过DNA芯片研究全局表达谱变化, 揭示了细菌入侵早期导致的巨噬细胞表达变化, 为深入研究结核分枝杆菌-宿主相互作用提供了基础数据和探索方向.     

DNA微阵列在结核分枝杆菌研究中的应用

高密度DNA微阵列技术可以通过一次杂交获得大量的基因组信息,广泛用于基因组结构和基因表达谱分析。本文简介DNA微阵列技术在结核分枝杆菌的功能基因组学,致病机理以及耐药机制,诊断等方面的应用。