基于CRISPR转录激活系统构建内源性着丝粒蛋白F稳定过表达的肝细胞癌细胞模型

临床研究表明着丝粒蛋白F(centromere protein F,CENPF)与肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的发生相关。由于CENPF蛋白的分子量高达358 kDa,目前有关CENPF致癌机制研究使用的体内外模型主要基于CENPF表达敲低,尚缺乏将CENPF过表达以探究其与癌变因果关系的研究,CENPF过表达改变到底是“因”还是“果”仍不清楚。本研究旨在利用包括lentiMPHv2和lentiSAMv2两个载体的CRISPR/dCas9转录激活协同激活介体(synergistic activation mediator,SAM)系统构建内源性CENPF稳定过表达的细胞模型,为阐明CENPF过表达与HCC发生发展的因果关系提供有效工具。首先设计并合成能够特异性识别CENPF基因转录起始位点的单向导核糖核酸(single guide RNAs,sgRNA),并将其插入lentiSAMv2质粒中。利用慢病毒载体将lentiMPHv2质粒导入Huh-7和HCCLM3细胞株中,用潮霉素B筛选后再用慢病毒载体将连接好的携带sgRNA序列的lentiSAMv2质粒导入细胞中,并用杀稻瘟菌素S继续筛选。对2种抗生素筛选获得的Huh-7和HCCLM3细胞株样品进行CENPF mRNA和蛋白表达水平的检测,结果显示sgRNA1和sgRNA4序列均能够激活内源CENPF的表达,其中sgRNA4诱导转录效果更加明显。本研究利用CRISPR/dCas9系统成功构建内源性CENPF稳定过表达的HCC细胞模型,为研究CENPF过表达与肿瘤发生的因果关系奠定基础,并为构建大分子量蛋白过表达的细胞模型提供参考方案。