人凝血因子Ⅷ制剂冻干工艺

优选了人凝血因子Ⅷ(FⅧ)制剂的冻干工艺。通过电阻法测定共晶点,再采用正交试验法,对预冻温度、主要干燥温度、主干燥时间、解析温度与真空压力等进行研究以优选冻干工艺,得到最佳的冻干工艺:-40℃预冻1.5 h;主要干燥温度从-40℃升温至-33℃,再从-33℃升温至0℃,总耗时36 h,真空压力为30 Pa;解析温度维持在35℃,真空压力为5 Pa,于终点测试压力无变化时结束。由于该工艺冻干出的人凝血因子Ⅷ制剂符合《中国药典》3部该项下的质量要求,经验证该冻干工艺能够应用于人凝血因子Ⅷ制剂的大规模生产。     

透明颤菌血红蛋白基因在刺糖多孢菌中整合表达促进多杀菌素的生物合成

为解决刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)高密度深层培养过程中的供氧不足问题, 促进多杀菌素的生物合成, 采用重叠PCR 技术将透明颤菌(Vitreoscillastercoraria)血红蛋白基因(vgb)可读框(ORF)置于红霉素抗性基因启动子(P_ermE)之下, 并将其克隆到整合型载体pSET152 上, 构建成vgb 表达载体pSET152EVHB; 通过接合转移方式将其导入刺糖多孢菌SP06081 中, 利用载体上ΦC31 整合性位点通过位点特异性重组将vgb 定点整合到SP06081 菌株染色体上, 获得一株遗传性能稳定的重组菌株S078-1101; 重组工程菌的PCR 与Southern blotting 检测显示vgb 已整合到染色体上, 一氧化碳结合差光谱分析表明在S078-1101 工程菌中表达了有活性的透明颤菌血红蛋白(VHb); 摇瓶发酵结果显示, 在正常溶氧与中度限氧状态下, vgb 的表达均可显著促进多杀菌素的生物合成(P<0.01). 这说明vgb 在刺糖多孢菌中的整合表达改善了菌体对溶氧的吸收性能, 是一种有效的定向遗传改良手段.     

多杀菌素生产菌原生质体的制备条件及其再生菌株生理特性

为了改良多杀菌素生产菌种,提高多杀菌素产量,研究了甘氨酸添加浓度、溶菌酶作用时间、温度和浓度对多杀菌素生产菌刺糖多胞菌Saccharopolyspora spinosaSP06081菌株原生质体制备和再生的影响,并考察了不同再生培养基和渗透压稳定剂对其再生的影响,确定了该菌株原生质体制备和再生的最佳条件。同时,对原生质体再生菌株的形态与多杀菌素产量变化进行了比较研究。结果表明:菌体在添加0.2%的甘氨酸的TSB培养基中培养48h收集,0.1mg/mL溶菌酶,28oC作用20min制备原生质体,将原生质体涂布于以蔗糖为渗透压稳定剂的R2YE培养基中,原生质体再生数目最多,达108个/mL以上;原生质体再生菌株在形态和抗生素产量上产生分化,29.3%的再生菌株形态上保持与亲本菌株一致,具有菌丝松散,断裂分枝多的特点,其中53.2%的再生菌株多杀菌素产量变异向正方向移动,最高产量达到582.0mg/L,比亲本菌株提高85.6%。原生质体再生菌株的形态分化与多杀菌素产量具有重要相关性。     

多杀菌素生物合成的分子机理与定向遗传改造策略

多杀菌素是由土壤放线菌刺糖多孢菌产生的次生代谢产物．主要活性物质为spinosyn A和spinosyn D,是一种新型的高效广谱大环内酯类杀虫剂,因其独特的杀虫机理而兼具生物农药的安全性与化学农药的快速性．简述了多杀菌素生物合成的分子机理,包括聚酮链的生物合成与修饰、NDP糖的合成、修饰与连接转移以及多杀菌素生物合成基因表达调控．通过对多杀菌素生物合成的限速步骤及相关基因的分析．探讨了提高多杀菌素产量与合成其新衍生物的定向遗传改造策略,并展望了其应用发展前景．