密码子优化后的αB-晶状体蛋白基因毕赤酵母重组质粒的构建及表达的初步研究

αB-晶状体蛋白属于小热休克蛋白家族,具有分子伴侣活性。在阿尔茨海默病大脑中,星形胶质细胞表达的αB-晶状体蛋白明显上调,并且这些上调的αB-晶状体蛋白紧密地分布在β-淀粉样蛋白沉积周围。为了在分子水平上研究胞外αB-晶状体蛋白在阿尔茨海默病中的作用机制,需要获得大量具有生物学活性的αB-晶状体蛋白。根据毕赤酵母密码子偏好性对人αB-晶状体蛋白基因进行优化,并在目的基因3'端加上6个组氨酸标签,优化后的基因克隆到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体p PIC9K上;电转入毕赤酵母GS115中;优化确定最佳表达条件为:BMGY与BMMY的转接比为2∶1,表达时间为72h,甲醇补加终浓度为0.5%;经Western blotting鉴定,获得20kDa的目的蛋白,以及18.6kDa和13.1kDa两个蛋白质片段,重组目的蛋白出现了部分降解,纯化获得20kDa目的蛋白;利用胰岛素还原法测定该片段具有分子伴侣活性,为进一步研究外源αB-晶状体蛋白在阿尔茨海默病中对星形胶质细胞的保护机制奠定基础。     

重组人死亡受体6胞外结构域的制备及与淀粉样前体蛋白N端片段相互作用鉴定

人淀粉样前体蛋白氨基端切割片段(a cleaved amino-terminal fragment of amyloid precursor protein,N-APP)结合死亡受体6(Death receptor-6,DR6),会触发神经元和轴突依赖天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的自我毁灭过程,从而导致阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的发生。为了在分子水平上研究N-APP-DR6诱导神经元退化途径,制备大量纯化的重组DR6胞外结构域以及鉴定NAPP和DR6胞外结构域的结合位点是关键。从甲醇毕赤酵母中成功表达并纯化了重组DR6胞外域(aa42-349),得率高达90 mg/L。为了验证DR6和NAPP的相互作用关系,构建谷胱甘肽转移酶-死亡受体6(GST-DR6)(aa42-349)融合蛋白原核表达质粒,转化大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)BL21,表达融合蛋白GST-DR6(aa42-349),同时纯化得到DR6的配体NAPP,GST pull-down结果显示DR6与NAPP能够在细胞外发生相互作用。