基因前定点敲入FLAG标签表达的FLAG-SND1蛋白参与胞内应激颗粒的形成

CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats-Cas9 nuclease) 基因编辑技术是近年来新兴的一种可以实现基因特异性敲除和敲入的技术。本文利用CRISPR/Cas9基因编辑系统,将3×FLAG标签定点敲入HeLa细胞SND1基因前方,使细胞内源性表达的SND1蛋白带有3×FLAG标签,并观察SND1与应激颗粒及加工体的定位情况。设计针对SND1基因起始密码子ATG附近的sgRNA,以px459为表达载体,构建出重组真核表达质粒。设计含有3×FLAG及待插入位置上下游150 bp同源臂的序列,经公司合成获得重组质粒。将2个质粒共同转染HeLa细胞,使用嘌呤霉素筛选阳性细胞,挑取单克隆后培养。Western 印迹表明,细胞表达3×FLAG-SND1融合蛋白质。提取细胞基因组DNA进行测序。测序无误获得稳定株后,用流式细胞术检测细胞周期和凋亡,发现与WT细胞相比无显著性差异。同时,使用0.5 mmol/L亚砷酸钠处理,细胞发生氧化应激,eIF2α蛋白磷酸化增加,胞浆中出现应激颗粒,SND1与应激颗粒标志蛋白TIAR存在共定位现象,但不存在与加工体蛋白DCP1α的共定位。     

PM_(2.5)致炎症作用及其机制研究进展

大气细颗粒物(PM2.5)能够深入下呼吸道,直达肺泡,并且能透过肺呼吸道屏障,进入循环系统,随血流而到达全身各靶器官,对其组织细胞造成伤害。除诱发呼吸系统疾病外,PM2.5还能致心血管疾病、糖尿病、恶性肿瘤等多种疾病的发生和发展。PM2.5致局部组织或系统的急性或慢性炎症、炎症细胞的浸润、炎症因子的异常表达与释放等,被认为是致人体健康损伤的重要机制。在综述PM2.5与炎症细胞的相互作用、炎症因子的表达与释放等致炎症效应新成果的基础上,概述了近年来人们对于PM2.5致炎症作用机制的新认识。     

Wnt与MAPK信号通路在肿瘤发生中的串话

Wnt和MAPK信号通路在生物进化过程中高度保守,参与调控胚胎发育和细胞增殖、分化及凋亡等。Wnt和MAPK信号通路调控失常可导致胚胎发育异常和肿瘤形成。近年来发现这两条信号通路在肿瘤发生发展中存在着大量串话（crosstalk）,彼此之间相互调节,共同发挥促癌或抑癌作用,因此,更好地了解两条通路是如何在肿瘤形成中发生交叉对话对于将来肿瘤治疗非常有价值。     

β-catenin的生物学功能与调控机制

β-连环蛋白（β-catenin）是一种胞内糖蛋白,具有双重功能。一是作为附着连接的组成部分,与钙黏蛋白结合形成复合体参与细胞间连接;二是作为信号分子,是Wnt信号途径的重要环节,在胚胎发育和肿瘤发生中起重要作用。β-catenin选择何种途径发挥作用,与不同配体竞争性结合密切相关。目前已经证实β-catenin Y142位点酪氨酸磷酸化是决定β-catenin功能的关键调控点,而E—cadherin、Left、APC和α-catenin均参与β—catenin活性的调节,对细胞的命运有着重要影响。     

病毒对抗RNAi的方式

RNAi是近几年的重大科学发现,其作用是对基因表达在转录后水平进行调控,同时RNAi还可以清除外源基因组或抑制外源基因组的复制。因此RNAi的重要功能之一就是宿主细胞抵抗病毒感染;另一方面,病毒也具有一套对抗RNAi的机制。对于这种相互作用过程的研究可从一个新的角度了解RNAi的功能和病毒感染过程。     

骨髓造血干细胞龛

造血干细胞（hematopoietic stem cell,HSC）位于骨髓的造血微环境即龛（niche）中,它们与龛内特定的细胞相互作用以调节其自我更新和定向分化。研究发现,骨髓中的成骨细胞和内皮细胞与造血干细胞关系密切,分别构成了HSC龛中的成骨龛和血管龛,其中成骨龛维持静态的HSC微环境,而血管龛调控HSC的增殖、分化和动员等行为。对骨髓HSC龛的研究为将来临床治疗血液系统相关疾病提供了新的思路。     

非对称性分裂调节因子hScrib和hDlg与恶性肿瘤

肿瘤干细胞的鉴定成功对肿瘤发生的观点产生了新的挑战。干细胞最大的特点是非对称性分裂从而实现自我更新,如果这一过程被扰乱则会发生肿瘤。肿瘤抑制基因hscrib、hJig被认为在这一分子机制中调节命运决定子在子代细胞中的分配。细胞极性是上皮组织的一个标志性特点,极性丢失与上皮的恶性转化密切相关。研究表明hScrib、hDlg是维持正常上皮极性的关键因子,在多种上皮性恶性肿瘤的发生中可能起一定作用。     

介导抑癌蛋白泛素化的新分子

抑癌蛋白泛素化机制在肿瘤发生发展过程中扮演重要角色。其中,NEDD4—1介导的PTEN泛素化与Cowden综合征密切相关,Livin介导的Smac／DIABLO泛素化,以及癌性锚蛋白重复序列、转录因子E4F1等介导的P53泛素化均在肿瘤发生过程中扮演重要角色。近期研究表明,这些介导抑癌蛋白泛素化的新分子有望成为肿瘤治疗的靶点。     

基因敲除技术现状及应用

功能基因组学的研究进展使基因敲除技术显得尤为重要。基因敲除技术从载体构建到细胞的筛选到动物模型的建立各方面都得到了发展。其中Cre—LoxP系统可以有效的控制打靶的发育阶段和组织类型,实现特定基因在特定时间和（或）空间的功能研究;转座子系统易于操作,所需时间短,具有高通量的特点,可以携带多种抗性标记,方便了同时进行多基因功能研究;基因捕获技术提供了获得基因敲除小鼠的高效方法,方便了进行小鼠基因组文库的研究。此外,进退策略、双置换法、标记和交换法、重组酶介导的盒子交换法也从不同方向发展了基因敲除技术。     

基因组差异甲基化片段筛选技术

分离和鉴定细胞之间的差异甲基化片段,不仅有助于了解基因的功能、分离疾病相关基因,而且可以发现与细胞分化或病变相关的甲基化标记。目前筛选差异甲基化DNA片段的方法主要有：甲基化敏感的限制性界标基因组扫描、甲基化敏感的代表性差异分析、甲基化敏感的限制性指纹技术、甲基化CpG岛扩增．代表性差异分析、微阵列技术等。其中微阵列法又先后建立有CpG岛微阵列、寡核苷酸微阵列和表达CpG岛序列标签微阵列。这些方法各有特点和适用范围,应根据具体研究目的和工作条件进行恰当的选择。