一些化学和物理因素对羊瘙痒因子263K蛋白酶抗性的影响

朊病毒(prion)具有超强的理化因素抵抗能力,可抵抗常规物理和化学因子对其感染性的灭活.为了研究不同理化因素对PrPSc蛋白酶抗性的影响,采用不同浓度的NaOH、NaOCl、SDS、温度变化以及3%SDS与温度变化联合处理羊瘙痒因子263K,再经蛋白酶K(Proteinase K,PK)消化,通过Western blot检测观测PrPSc的PK抗性.结果发现,上述几种理化因素对羊瘙痒因子263K的PK抗性有不同程度的破坏作用.NaOH浓度在0.05mol/L以上,NaOCl游离氯含量在0.1%以上,温度在121℃以上都能使PrPSc的PK抗性消失;而1%～5%SDS不能使PrPSc的PK抗性完全消失,3%SDS与温度的联合作用可有效地破坏PK抗性,同时使所需温度降低.还发现,在较低浓度的化学因子或温度的条件下即可出现PK抗性的破坏,而在较高浓度或温度处理时才出现蛋白本身的消失.这些结果提示,与PrPSc感染性的结果相似,PK抗性可受相似浓度或强度的理化因素影响,具有明显的浓度或强度相关性,对判定消除PrPSc的感染性有一定的指导意义.     

羊瘙痒病263K毒株感染的仓鼠脑中PrP分子形式多样性的动态测定

正常细胞的朊蛋白(PrPC)代谢和构象的改变是引发动物和人类可传播性海绵状脑病(transmissiblespongiformencephalopathies,TSEs)的根本原因。将羊瘙痒病(scrapie)仓鼠适应株263K颅内接种仓鼠,在接种后的第20、40、50、60、70、80天,通过Westernblot动态检测仓鼠脑中PrP存在的形式。结果在接种后第40天,在感染动物脑组织中即检测到PrPSc分子,比临床症状出现的时间早(平均潜伏期为66 7±1 1天),且无糖基化形式的PrP分子所占百分比在接种后期增加明显。除了标准分子量大小(30kD～35kD)的PrP分子外,在感染动物脑中存在着高分子量和低分子量形式的PrP分子。定量分析显示,随着接种潜伏期的延长,不同形式PrP分子的含量也在增加,其中低分子量形式的PrP分子与临床症状的出现密切相关。蛋白去糖基化实验表明,在感染动物脑组织中,除了标准分子量大小的PrP蛋白外,还存在一条更小分子量的PrP条带,而正常动物脑组织仅存在标准大小的PrP分子。低分子量形式的PrP分子具有与全长PrP分子相类似的糖基化模式。结果提示,scrapie263K感染的仓鼠脑组织中存在不同分子形式的PrPSc,其PrP分子的代谢可能不同于正常动物。     

哀牢山中山湿性常绿阔叶林土壤氮转化的海拔效应

采用树脂芯法将哀牢山中山湿性常绿阔叶林内土壤分别移植到中海拔的次生林和低海拔的人工林下培养,并以原地培养为对照,对土壤氮素转化的海拔效应进行了研究.土壤氮素的净矿化速率、净硝化速率和淋溶速率受季节和海拔的影响极为显著(P＜0.01).海拔的影响在雨季前期最显著,高海拔土壤的净矿化和净硝化速率分别为-5.81和-4.18mg N·kg-1·60d-1,移植到中、低海拔培养后,净矿化速率分别为20.92和44.15 mgN·kg-1· 60 d-1,净硝化速率分别为17.07和20.38 mgN· kg-1 ·60d-1,淋溶量也分别增加了0.37倍和2.77倍.由于雨季中后期反硝化作用增加导致净矿化和净硝化速率降低,导致高、中海拔培养的土壤净氮矿化速率在雨季中期达到最高值,雨季后期降低.由此可推断,未来的气候变暖很可能会加快哀牢山中山湿性常绿阔叶林土壤氮素的转化速率和气态损失量.     

一种新的PrP无细胞构象转化系统的建立

PrP细胞外构象转化系统已经被一些实验室用于朊病毒的研究,但在反应体系中往往需要使用放射性同位素。为了建立一种安全方便的PrP无细胞构象转化系统用于TSE发病机制的研究,通过PCR方法获得仓鼠PrP(HaPrP)全长基因,克隆至原核表达载体pQE30,在大肠杆菌中表达并纯化出分子量为27kD HaPrP蛋白,Western blot证实可与PrP特异性单克隆抗体反应。将纯化蛋白在体外标记生物素(Biotin-7-NHs),与纯化的scrapie 263K毒株仓鼠感染脑组织PrP^Se蛋白共同孵育4天后,经蛋白酶K消化,Western blot检测,证明存在一条抵抗蛋白酶K消化的、被亲和素特异性识别的条带,其分子量约为20kD。这表明HaPrP^sen可以被转化为HaPrP^res。实验表明,可以利用原核系统取代真核系统表达PrP,并用生物素标记取代^35S标记纯化蛋白,建立一个更加安全方便的无细胞构象转化系统,用于朊病毒的研究。     

朊毒体病治疗对策的研究进展

朊毒体病又称传染性海绵状脑病(TSE),是一类人畜共患的慢性、致死性中枢神经系统退行性疾病,可表现为传染性、遗传性和散发性3种形式。朊蛋白PrP^c向PrP^Sc的转化以及PrP^Sc的复制是TSE致病的关键。目前已发现多种化合物可针对朊毒体扩散和复制的不同环节在体外或动物模型中发挥一定的抗朊毒体活性,其中几种药物已进行了初期临床试验。近年来PrP抗体的研究引起了人们广泛的兴趣,提示主、被动免疫可能成为有效的防治策略。     

N端八肽重复区数目对人重组PrP与金属离子结合后的蛋白酶抗性及与tau蛋白结合能力的影响

人类朊病毒病中约10％～15％具有家族遗传特性,其中插入或缺失突变多发生于PrP蛋白N末端的八肽重复区域。运用PCR成功地构建并表达了含不同八肽重复数目的PrP蛋白,并观察八肽重复数目的增加对PrP与Cu^2＋等二价离子以及tau蛋白的相互作用的影响。实验结果显示：各种纯化后的PrP蛋白对常规浓度PK消化是敏感的,而与Cu^2＋共同孵育可使PrP蛋白的PK抗性增强;八肽重复序列的数目及Cu^2＋的浓度决定了PK抗性的出现和强弱。另外,MnH可诱导产生与CuH相似的结果,但其诱导效应似乎低于CuH,而Zn^2＋对PrP蛋白的PK抗性无影响。GST—tau包被的ELISA检测证实,重组的PrP呈现出明显的tau蛋白结合能力,并且与八肽重复序列的数量相关,重复序列数量越多,结合能力越强。这些结果提示,CuH诱导产生的PrP蛋白PK抗性是通过八肽重复序列区域产生的,并且直接与重复序列的数量相关。另外,PrP蛋白八肽重复序列的存在和数量直接影响PrP与tau蛋白的结合效应。除了八肽区域外,PrP蛋白其它区域似乎也具有一定的tau蛋白结合能力。     

羊瘙痒因子263K感染仓鼠终末期脑中胶质纤维酸性蛋白和神经元特异性烯醇化酶的表达和分布变化研究

为了探讨羊瘙痒因子263K感染仓鼠脑组织中星形胶质细胞和神经元的数量及功能改变,利用免疫印迹、免疫组化方法研究了胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)在受染仓鼠各脑区中表达变化的特点,同时比较其与神经病理学改变及PrPSc沉积的关系.结果表明,感染终末期仓鼠的脑组织中GFAP表达量明显增高,与正常对照相比,大脑皮质、脑干和小脑区域GFAP着色细胞数量分别增高3.69、2.41和1.56倍.感染仓鼠脑组织NSE表达量低于正常对照,小脑、海马CA1区和大脑皮质NSE着色细胞数量分别仅为正常对照相应区域的22.5%、54.2%和53.9%.这些变化与PrPSc在脑组织中的沉积程度和空泡样变性程度相吻合.结果提示,GFAP和NSE的检测可分别很好地反映星形胶质细胞和神经元的数量及功能状态,成为在朊病毒病发病过程中重要的病理变化指标.     

羊瘙痒病小鼠适应株139A可突破种属屏障颅内感染金黄地鼠

羊瘙痒病感染因子可以根据疾病发生的潜伏期、临床病程、神经病理学特征以及PrPSc分子特征等分为不同的毒株,目前已经证实有20余种.在可传播性海绵状脑病的发病过程中存在着明显的种属屏障作用.将小鼠适应株139A颅内接种至金黄地鼠,以观测感染因子对种属屏障的突破及感染特征.在接种385～405天后,感染动物出现明显症状,与以往报道的金黄地鼠适应株263K不同,139A毒株发病动物出现严重的瘙痒,而无明显的共济失调.感染动物自出现明显症状到死亡的时间明显长于263K毒株感染金黄地鼠.进一步脑组织电镜和Western blot检测证实,存在有羊瘙痒病相关纤维和PrP-res.这证明小鼠适应株139A可突破种属屏障感染金黄地鼠.经系统比较,139A和263K毒株在潜伏期、主要临床症状和临床病程显示出明显的差异,而PrP-res的泳动位置和糖基化比率差异不大,仅139A毒株的单糖基化分子位置似乎略高于263K.动态观测处于潜伏期的接种动物脑组织羊瘙痒病相关纤维和PrP-res,发现PrPSc的出现明显早于临床症状.     

模拟降雨对西双版纳热带次生林和橡胶林土壤呼吸的影响

降雨作为一个重要的环境因子,对土壤呼吸具有重要的影响。研究土壤呼吸与降雨的关系,对准确估算大气中的CO2含量具有重要意义。本研究通过人工模拟降雨事件,应用野外原位测定方法,测量了热带次生林和橡胶林土壤呼吸速率、地下5cm土壤温度和土壤含水量的变化,以探究热带两种主要植被类型的土壤呼吸、土壤温度、土壤含水量对旱季单次降雨事件的响应过程与规律。研究发现,在旱季连续一周没有降雨的情况下,人工模拟降雨事件使土壤呼吸在降雨后的2h内被迅速激发,次生林的土壤呼吸最大达到11.15 μmolCO2·m-2·s-1,是对照的近7倍;橡胶林的土壤呼吸最大达到了15.88 μmolCO2·m-2·s-1,是对照的近11倍。随后激发效应迅速降低,尤其是橡胶林,在人工模拟降雨6h后处理与对照间无显著差异。人工模拟降雨前两种林型的土壤含水量与对照相比均无显著性差异,人工模拟降雨后的2d内土壤含水量均显著高于对照;人工模拟降雨前后土壤温度与对照相比均无显著性差异。本研究结果支持了"Birch effect",2种主要热带林型在旱季时期,由于单次降雨事件激发而释放到大气中的CO2是降雨前的数倍。