豹蛙抗瘤酶的毕赤酵母高效表达、纯化及活性测定

豹蛙抗瘤酶(Onconase,ranpirnase,ONC)对体内外多种肿瘤有很强的杀伤作用,是当前全球重点研究的100种新药之一,为获得高表达与高活性的重组豹蛙抗瘤酶(Recombination onconase,rONC),根据成熟ONC的cDNA序列和毕赤酵母密码子偏好性设计基因并提高其GC含量,分泌信号肽采用酵母α交配因子的pre肽,分别构建表达载体pPIC9/ONC、pPIC9K/ONC和pPICZα-A/ONC,并转染毕赤酵母X-33、GS115和SMD1168,筛选阳性克隆并进行诱导表达。在摇瓶规模筛选最佳载体-宿主组合及优化培养条件之后,进行10 L规模最优培养基的筛选,发酵产物经双水相萃取偶联G50凝胶层析分离纯化。结果表明,pPICZα-A/X-33/ONC组合表达量优于其他组合,且在p H 5.5、23℃条件下诱导7 d,最高表达量达到13 mg/L;在10 L规模条件下,rONC于pH 5.5的低盐基础培养基(Lower basic salt medium,LBSM)、甲醇浓度0.25%条件下诱导7 d,最高表达量为180 mg/L;纯化后的rONC纯度≥95%,收率高于90%;生物活性检测发现,rONC在体外能杀伤多种癌细胞。初步建立了rONC的高效表达与纯化体系,为后续的功能和作用机理研究奠定了一定基础。