单核细胞增多性李斯特菌氨基肽酶Lmo1711体外表达及其酶活分析

对单核细胞增多性李斯特菌(简称单增李斯特菌)lmo1711基因编码的氨基肽酶进行克隆表达与纯化,并研究该重组蛋白的体外酶学特性。首先通过生物信息学分析预测Lmo1711与氨基肽酶家族成员的亲缘关系及关键活性位点的保守性。利用SWISS-MODEL模拟预测该蛋白的空间结构;构建Lmo1711原核表达载体并转化入E.coli Rosetta中,诱导表达重组目的蛋白,并利用镍离子亲和层析方法纯化目的蛋白;以氨基酸-对硝基苯胺偶联物为底物,Lmo1711通过水解底物N端氨基酸残基产生游离对硝基苯胺单体,405 nm处检测吸光值对该产物进行检测从而分析Lmo1711的酶学特性。在此基础上系统研究Lmo1711对不同氨基酸残基底物的催化特异性,及不同金属离子对该酶活性的影响。经原核表达纯化获得49.3 kDa的重组Lmo1711蛋白,与预测分子量一致;生物信息学分析推测Lmo1711属于M29氨基肽酶家族,且存在保守关键氨基酸活性位点(Glu250、Glu316、His345、Tyr352、His378、Asp380);酶活分析显示,Lmo1711具有较强的氨基肽酶活性,针对不同底物的结合和催化能力差异较大,对亮氨酸残基的亲和程度最高;Lmo1711氨基肽酶活性具有金属离子依赖性,Co~(2+)、Cd~(2+)、Zn~(2+)等多种金属离子均能显著增强其活性,其中Co~(2+)的激活效应最显著。本试验首次发现并证实,单增李斯特菌Lmo1711属于M29氨基肽酶家族成员,具有较强的催化活性,且对金属离子具有不同程度的依赖性。     

单增李斯特菌溶血素O的PEST序列激活ERK1/2磷酸化的作用

[目的]本研究旨在构建单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes,简称单增李斯特菌)溶血素O(Listeriolysin O,LLO)的关键结构域PEST序列(包含S44、S48和T51关键磷酸化位点)突变体,并针对其生物学功能展开研究。[方法]以李斯特菌参考菌株EGD-e为模板扩增编码LLO的hly基因,克隆至pET30a(+)原核表达载体,在此基础上利用氨基酸突变技术获得表达PEST突变体(LLO△PEST、LLOS44A、LLOS48A和LLOT51A)的重组质粒,转入E.coli Rosetta感受态细胞中,诱导表达重组蛋白经镍离子亲和层析纯化后进行SDS-PAGE分析。利用红细胞裂解试验检测重组蛋白的溶血活性,并通过Western blotting检测重组突变蛋白刺激Caco-2细胞后对MAPK关键信号分子ERK1/2磷酸化水平变化的影响。[结果]结果显示,本研究成功获得重组LLO及其突变体蛋白LLO△PEST、LLOS44A、LLOS48A和LLOT51A。在pH5.5和7.4条件下,LLO△PEST、LLOS44A、LLOS48A和LLOT51A均具有和LLO相当的溶血活性,说明PEST序列缺失或突变并不影响LLO的膜裂解活性。研究进一步发现,重组LLO及其突变蛋白刺激Caco-2细胞后均能激活ERK1/2的磷酸化。[结论]研究表明LLO的关键结构域PEST序列对于维持该蛋白的膜裂解能力及穿孔活性并非必需,且该结构域的缺失不影响李斯特菌在感染宿主时依赖LLO介导ERK1/2磷酸化的生物学过程。本研究将为进一步探索细菌感染过程中PEST序列对于LLO发挥生物学功能的潜在作用及分子机制奠定基础。