鼠肝DNA甲基化酶的纯化及物理化学性质的研究

以Ｗｉｓｔａｒ大鼠肝为材料,确立了一个简便的纯化鼠肝ＤＮＡ甲基化酶的程序,包括：细胞的超声破碎、去内源核酸、硫酸铵盐析、磷酸纤维素亲和层析、ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ－５０柱层析及ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１５０凝胶过滤。用不同浓度聚丙烯酰胺凝胶电泳和孔梯度凝胶电泳检测,纯化后的酶已达电泳均一,且酶的比活力提高１１２倍。以聚丙烯酰胺孔梯度凝胶电泳测得其天然酶的分子量为３６５ｋＤ,以ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳测得该酶有两种亚基,大亚基为９５ｋＤ,小亚基为８５ｋＤ,推测该酶由两个大亚基和两个小亚基组成。     

5－氮－2＇－脱氧胞苷（5－aza－CdR）对HL－60细胞分化和DNA甲基化酶的影响

以５－氮－２＇－脱氧胞苷（５－ａｚａ－ＣｄＲ）为诱导物,在０．５μｍｏｌ／Ｌ的最佳浓度下,可诱导ＨＬ－６０细胞分化达１５％左右。同时,用［￣３Ｈ］－ｍｅｔｈｙｌ－ｓ－ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ（￣３Ｈ－ＳＡＭ）为底物,通过同位素参入法,测定了不同浓度诱导物对ＨＬ－６０细胞ＤＮＡ甲基化酶活力的影响,发现在最佳诱导物浓度下,可使ＨＬ－６０细胞ＤＮＡ甲基化酶活力明显下降,此外,也比较了不同分化水平的ＨＬ－６０细胞中具有不同甲基化水平的ＤＮＡ在体外接受甲基的能力,从而证明５－ａｚａ－ＣｄＲ诱导ＨＬ－６０细胞分化与其ＤＮＡ甲基化状态密切相关。     

从基因工程菌分离纯化心钠素

以高效表达的基因工程菌为材料,对以包涵体形式存在的目的产物——心钠素（ＡＮＦ）融合蛋白进行了酶切及分离纯化．先用ＴｒｉｔｏｎＸ－１００和低浓度尿素、盐酸胍洗涤,提高包涵体的纯度．再用高浓度的尿素处理,使蛋白变性溶解,脱氧胆酸钠对蛋白有明显的促溶作用．解决变性蛋白质去除变性剂时的聚合问题．在非变性条件下进行ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５凝胶过滤,ＦＰＬＣ系统纯化,得到目的融合蛋白．用凝血酶对融合蛋白作特异性切割,释放出ＡＮＦ小肽,经ＦＰＬＣ分离鉴定,与标准ＡＮＦ有相同的ＴＲ值,说明其纯度已达均一．生物活性检测表明：有明显的放免活性和舒张血管、利尿的生理活性     

甲基化作用对M.L.DMA大分子构象的影响

本文用Hha I DNA甲基化酶为工具酶,制备了不同甲基化水平的Micrococcus IuteusDNA,再用Sephadex G-100凝胶过滤将甲基化了的M.L.DNA分离出来.以园二色差光谱和紫外差光谱等手段检测了不同甲基化水平给M.L.DNA大分子造成的构象变化:随着DNA甲基化水平的的升高,其CD差光谱的值,及紫外差光谱的值均呈增加趋势.这说明DNA大分子的甲基化,使其分子在溶液中变得更为缩拢,而这种缩拢的程度与DNA大分子的甲基化水平呈正相关.     

人心肌肌凝蛋白轻链(CMLC)的分离及临床应用

从人心肌提取了肌凝蛋白,并检测了其ATP酶活力的稳定性。用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法纯化并鉴定了人心肌肌凝蛋白轻链(CMLC),结果表明CMLCI的分子量为27000;CMLCⅡ的分子量为20 000。它们的紫外吸收光谱显示A260>A280,表明其高含苯丙氨酸。制备了兔抗人CMLC抗血清,免疫双扩散的结果表明,纯化后的CMLC与肌凝蛋白有相同的抗原性。用阳性的兔抗人CMLC抗血清为对照作ELISA实验,不仅从免疫学角度进一步证实了人心肌CMLC的特性且为其在临床诊断应用提供了可靠的方法。     

5—氮—2‘—脱氧胞苷（5—axa—CdR）对HL—60细胞分化和DNA甲基化酶的影响

以５－氮－２－脱氧胞苷为诱导物,在０．５μｍｏｌ／Ｌ的最佳浓度下,可诱导ＨＬ－６０细胞分化达１５％左右。同时,用「＾３Ｈ」－ｍｅｔｈｙｌ－ｓ－ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ（＾３Ｈ－ＳＡＭ）为底物,通过同位数参入法,测定了不同浓度诱导物对ＨＬ－６０细胞ＤＮＡ甲基化酶活力的影响,发现在最佳诱导物浓度下,可使ＨＬ－６０细胞ＤＮＡ甲基化酶活力明显下降。     

甲基化作用对M.L.DMA大分子构象的影响

本文用Hha I DNA甲基化酶为工具酶,制备了不同甲基化水平的Micrococcus IuteusDNA,再用Sephadex G-100凝胶过滤将甲基化了的M.L.DNA分离出来.以园二色差光谱和紫外差光谱等手段检测了不同甲基化水平给M.L.DNA大分子造成的构象变化:随着DNA甲基化水平的的升高,其CD差光谱的值,及紫外差光谱的值均呈增加趋势.这说明DNA大分子的甲基化,使其分子在溶液中变得更为缩拢,而这种缩拢的程度与DNA大分子的甲基化水平呈正相关.