棉铃虫和甜菜夜蛾中肠丝氨酸蛋白酶活性测定以及活化、降解Cry1Ac毒素分析

昆虫中肠对Bt原毒素活化与对活化毒素降解的变化被认为是害虫对Bt产生的机制之一,研究比较棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)与甜菜夜蛾Spodoptera exigua(Hübner)的中肠液、BBMV蛋白酶的活性,通过SDS-PAGE分析2种昆虫对原毒素的活化速度与对活化毒素的降解速度。2种昆虫的中肠液蛋白酶活性均显著高于BBMV蛋白酶活性,中肠液与BBMV均能迅速活化原毒素并继续降解活化后的毒素,与中肠液相比,BBMV对原毒素的活化与对活化毒素的降解均慢于中肠液,甜菜夜蛾对毒素的活化与降解又慢于棉铃虫。另外,还测定抑制剂对中肠液蛋白酶活性的抑制作用,结果表明,各抑制剂对棉铃虫和甜菜夜蛾相应酶活性的抑制表现出相同的趋势,TLCK对丝氨酶蛋白酶具较好的抑制作用,而PMSF对胰蛋白酶的抑制作用次之,TPCK对胰凝乳蛋白酶的抑制作用较弱。     

棉铃虫幼虫中肠细胞脂筏的制备及鉴定

脂筏是细胞膜上富含胆固醇、鞘脂类和糖基磷脂酰肌醇锚着蛋白的去垢剂不溶性微结构域,被认为是多种细胞膜孔毒素在细胞表面形成寡聚体的平台。为研究脂筏与Bt毒素在细胞膜上形成寡聚体膜孔的关系,本文对棉铃虫Helicoverpa armigera幼虫中肠脂筏的制备与鉴定方法进行了研究。根据脂筏在低温（4℃）下不溶于去垢剂的特性,采用Triton X-100处理棉铃虫幼虫中肠刷状缘膜囊泡,溶解非脂质筏成分,以OptiPrep为介质进行密度梯度离心,分离去垢剂不溶组分,成功地得到了棉铃虫幼虫中肠上皮细胞的脂筏。再以脂筏的特有化学成分神经节苷脂GM1作为脂筏的标志分子,利用霍乱毒素β亚基能与GM1特异性结合的特性,以辣根过氧化物酶标记的霍乱毒素β亚基用点印迹法化学发光检测神经节苷脂的分布,从而对脂筏进行定性鉴定。结果表明我们建立的脂筏制备方法简便、易行,比传统的蔗糖梯度离心法大大缩短了制备所需时间。     

棉铃虫和甜菜夜蛾中肠丝氨酸蛋白酶活性测定以及活化、降解CrylAc毒素分析

昆虫中肠对Bt原毒素活化与对活化毒素降解的变化被认为是害虫对Bt产生的机制之一,研究比较棉铃虫Helicoverpa armigern（Hǔbner）与甜菜夜蛾Spodoptera exigm（Hǔbner）的中肠液、BBMV蛋白酶的活性,通过SDS-PAGE分析2种昆虫对原毒素的活化速度与对活化毒素的降解速度。2种昆虫的中肠液蛋白酶活性均显著高于BBMV蛋白酶活性,中肠液与BBMV均能迅速活化原毒素并继续降解活化后的毒素,与中肠液相比,BBMV对原毒素的活化与对活化毒素的降解均慢于中肠液,甜菜夜蛾对毒素的活化与降解又慢于棉铃虫。另外,还测定抑制剂对中肠液蛋白酶活性的抑制作用,结果表明,各抑制剂对棉铃虫和甜菜夜蛾相应酶活性的抑制表现出相同的趋势,TLCK对丝氨酶蛋白酶具较好的抑制作用,而PMSF对胰蛋白酶的抑制作用次之,TPCK对胰凝乳蛋白酶的抑制作用较弱。