三疣梭子蟹NF-κB家族基因Relish和Dorsal的克隆及表达特征

为研究Relish和Dorsal在三疣梭子蟹免疫过程中所起到的作用, 研究利用RACE技术克隆获得三疣梭子蟹Relish(Pt-Rel)、Dorsal基因(Pt-Dor) cDNA全长, 并通过实时荧光定量PCR技术分析了Pt-Rel和Pt-Dor基因在健康蟹不同组织及其原代培养的血淋巴细胞在感染不同微生物后的表达情况。结果显示, Pt-Rel cDNA长3254 bp, ORF长2949 bp, 编码983个氨基酸, Pt-Dor cDNA长2348 bp, ORF长1911 bp, 编码637个氨基酸; 蛋白结构预测分析发现Pt-Rel和Pt-Dor均包含RHD (Rel homology domain)及IPT (Immunoglobulin-like fold, Plexins, TranscriPtion factors)Rel/NF-κB家族蛋白经典结构域。Pt-Rel和Pt-Dor与其他节肢动物Relish、Dorsal氨基酸序列具有很高的相似性; 在系统进化分析中Pt-Rel和Pt-Dor分别与中华绒螯蟹等甲壳动物的Relish、Dorsal聚在一支, 而昆虫类聚在另一支。Pt-Rel和Pt-Dor在检测的6种组织中均有表达, 且2个基因均在血淋巴细胞中表达量最高。蟹血淋巴细胞体外感染实验结果表明, 不同病原微生物对2个基因表达的影响非常相似, 假丝酵母在2h明显诱导了Pt-Rel和Pt-Dor基因的表达, 而金黄色葡萄球菌及溶藻弧菌在感染4h后使Pt-Rel和Pt-Dor基因的表达显著上调。上述研究结果表明Pt-Rel和Pt-Dor基因很有可能参与了三疣梭子蟹的抗感染免疫过程。     

基于谷氨酸消旋酶基因(murI)构建杀香鱼假单胞菌减毒活疫苗株的染色体-质粒平衡致死表达系统

【目的】构建一种基于谷氨酸消旋酶(MurI)基因的染色体-质粒平衡致死系统,用于杀香鱼假单胞菌减毒活疫苗株(Pseudomonas plecoglossicida ΔtssD-1, Pp ΔtssD-1)中表达外源抗原,为开发多联活疫苗提供新的思路和方法。【方法】利用同源重组技术,将亲本株Pp ΔtssD-1中的murI基因敲除,构建murI基因缺失突变株;将广宿主穿梭质粒pBBR1MCS-2的卡那霉素抗性基因替换为murI基因,构建平衡致死质粒(即无抗性回补质粒);在平衡致死质粒的多克隆位点处插入绿色荧光蛋白以检测外源抗原是否稳定表达,对重组菌株进行生物学特性分析,包括生长曲线、质粒稳定性和外源抗原表达水平。【结果】murI基因缺失株在不含D-谷氨酸的LB培养基上无法生长;无抗性回补株在不含D-谷氨酸的LB培养基上恢复了生长能力,但生长速度低于亲本株;经鉴定外源抗原可在无抗性质粒中稳定表达,并可在荧光显微镜下观察到明显的绿色荧光信号;此外,平衡致死质粒在重组菌株中具有良好的遗传稳定性。【结论】本研究以murI为靶点构建了新型的染色体-质粒平衡致死系统,可在无抗性筛选条件下在Pp ΔtssD-1中表达外源抗原,为开发多联活疫苗提供了新的策略和方法。     

HRCA技术在转基因植物检测中的应用

超分支滚环扩增技术（Hyperbranched rolling cycle amplification, HRCA）在近几年中逐渐引起人们的注意,并越来越多的用于基础研究和实际检测中。在本文中我们对该技术在转基因植物检测中的应用情况作了较全面的探索;根据4种转基因植物中常用的外源基因或DNA片段设计了4条锁式探针（Padlock probe）,利用质粒pKK2328中的一段序列作为锁式探针中的共同连接部分,并根据该共同的连接部分序列设计一对通用的HRCA引物;利用同位素标记的锁式探针对HRCA反应中的连接一步的特异性研究表明,只有当锁式探针和相应的检测靶DNA同时存在于连接体系中时,锁式探针才能被有效地进行连接,从线性分子变为环型分子,在没有相应靶DNA存在时锁式探针仅以线性形式存在;连接时间的研究表明,如果所检测的靶DNA是质粒或较短的DNA片段时,较短的连接时间（5～10min）就可以取得理想的最终检测效果,如果检测的靶DNA是复杂的植物基因组DNA时,连接时间需要较大程度的延长（30～60min）才能取得理想的最终检测结果;HRCA的反应时间研究表明,较长的反应时间可以明显增加最终产物的量;对Bst DNA聚合酶大片段酶用量的研究表明,在其它条件不变的情况下酶的用量可以在较大的范围内变化（0.5u～4u）而不影响最终检测结果;在上述研究的基础上,对转基因烟草进行实际检测,取得了与预期一致的理想结果。为了提高检测效率,仿效复合式PCR（Multiplex PCR,MPCR）的原理采用复合式HRCA（Multiplex HRCA, MHRCA）方法对转基因烟草进行检测,并利用反向点杂交进行结果分析,取得同预期完全一致的结果。我们的研究表明HRCA方法完全可以用于转基因植物的检测,而且其使用比MPCR技术更方便,效率更高。     

人睫状神经营养因子在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达和生物活性测定

The recombinant human ciliary neurotrophi factor(hCNTF)expressed in E.coli aggregatedas inclusion bodies and refolding procedure was necessary to obtine the active protein.To overcome the disadvantage,we cloned hcntf gene into yeast expression plasmid pPIC9K and collected the plasmid pPIC9K-hcntf.Plasmid pPIC9K-hcntf was transformed into yeast Pichia pastoris GS115,and screened on G418-SD plates.The transformants with high copies of hcntf gene were inoculated into BMMY media and induced with 0.5% methanol.The recombinant hCNTF was secreted into the media.The amount of hCNTF in the supernatant was about 10 mg/L when incubated in the conical flasks and reached up to 60 mg/L under fed-batch condition in 15 L fermentator.The recombinant hCNTF expressed in E.coli was renatured as the control.The neonatal rat dorsal root ganglion assay showed that proteins expressed in both systems have the activity of promoting the growth of neuron axons.The phenomenon can be observed with only 3 μg hCNTF expressed in yeast present,which indicates that hCNTF was successfully expressed in Pichia pastoris and has a relatively high activity.     

饲料中铜、钙水平对大黄鱼幼鱼生长、抗氧化酶及脂代谢酶活性的影响

为研究钙对摄食高铜饲料的大黄鱼幼鱼生长性能、抗氧化酶类及脂代谢酶类活性的影响,研究采用22双因子实验设计,配制了4组实验饲料,共包含2个铜水平(4和24 mg/kg)和2个钙水平(0.5%和3%),分别命名为: -Cu-Ca、+Cu-Ca、-Cu+Ca和+Cu+Ca,饲喂大黄鱼幼鱼[(4.050.31) g]10周,每个处理组设置3个重复。结果表明,高铜组(+Cu-Ca和+Cu+Ca)实验鱼的存活率、终末体质量和增重率显著低于低铜组(-Cu-Ca和-Cu+Ca)(P0.05); 高铜组实验鱼肝脏和肌肉中的铜含量显著高于低铜组,而高钙组(-Cu+Ca和+Cu+Ca)实验鱼肌肉中的铜含量却显著低于低钙组(-Cu-Ca和+Cu-Ca)(P0.05); 高铜组实验鱼肝脏中的糖原含量显著低于低铜组(P0.05); 实验鱼肝脏中的超氧化物歧化酶、过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶、6-磷酸葡糖酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶和脂肪酸合成酶活性,高铜组显著低于低铜组,而高钙组却显著高于低钙组,但硫代巴比妥酸反应物含量和脂蛋白脂肪酶活性正好相反(P0.05); 饲料中铜和钙的交互作用显著影响了实验鱼肌肉中的铜含量、硫代巴比妥酸反应物含量、6-磷酸葡糖酸脱氢酶、脂肪酸合成酶和脂蛋白脂肪酶活性(P0.05)。研究表明,钙能够缓解摄食高铜饲料对大黄鱼幼鱼造成的伤害。     

膜蛋白LASS2的表达研究

利用多种原核表达系统、真核体外翻译系统和细菌/杆状病毒(Bac to Bac)的昆虫表达系统对一个具有重要生理功能的人的膜蛋白LASS2(Homo sapienslongevity assurance homologue 2 of yeastLAG1)进行表达研究。在原核表达系统中仅能够表达其羧基端胞外区片段却不能表达完整的LASS2蛋白,并制备了该片段的抗体。完整的LASS2蛋白能够在两种真核表达系统中进行表达,SDS-PAGE分析结果表明,表达产物分子量为约28kD的LASS蛋白, Western印迹分析也证实了这一结果, 并利用Ni-NTA树脂亲和层析将该蛋白纯化,纯度达到90%以上。     

利用MPCR方法快速检测植物转基因背景

利用复合ＰＣＲ（Ｍｕｌｙｉｐｌｅｘ ＰＣＲ－ＭＰＣＲ）技术对植物的转基因背景进行检测。经过对ＤＮＡ方法的选择,对各种ＰＣＲ程序的比较以及对引物的修饰,建立了一种快速检测植物转基因情况的技术;利用该技术对５个大豆样品,６个豆粕样品进实验检测,同时利用普通ＰＣＲ方法对上述样品进行检测,两者的结果完全符合。