一种简单高效的酵母单菌落 PCR 方法

目的:为快速简便地挑选出酿酒酵母重组克隆,探索建立一种经济、直接、高效的酵母单菌落 PCR 方法.方法:以 Leu2MX6基同重组或重组质粒转化得到的酵母突变菌为材料,分别采用传统的提取基组或质粒的方法、煮沸法及化学试剂处理法等制备 PCR 模板进行重组克隆鉴定,并对6种 PCR 模板制备方法的效果进行比较与分析;对加热提取法进行优化并进行重组子的提取和验证.结果与结论:直接以1 mm2单克隆菌株95℃处理5 min 后的酵母菌落水悬浮液为模板进行单菌落 PCR,是一种简单高效的酵母重组克隆鉴定方法.该方法能弥补传统方法的不足,且简便快速、结果稳定,可作为筛选和鉴定阳性克隆的有效手段.同时,这种单菌落 PCR 法也可应用重组毕赤酵母的阳性克隆筛选.     

泥鳅MnSOD基因的电子克隆及序列分析

目的:电子克隆并分析泥鳅MnSOD基因.方法:通过电子克隆泥鳅MnSOD基因的开放阅读框,并对其氨基酸组成、功能结构域、系统进化、信号肽、二级结构、三级结构等信息进行预测分析.结果:通过电子克隆获得泥鳅MnSOD基因的cDNA.该基因的开放阅读框大小为675bp,编码224个氨基酸残基,推导的蛋白质分子量为25kDa,等电点约为8.41,其编码序列与其他物种相比非常保守,与鲤形目淡水鱼的MnSOD在进化上亲缘关系最近.其N端含转运肽,推测它定位于线粒体中.预测泥鳅MnSOD的二级结构及三级结构含有较多的不规则卷曲和α螺旋,其N端为两个长的反平行螺旋,C端则为含有拧成三股折叠片的α+β结构.结论:该研究为泥鳅进一步的分子生物学及抗氧化研究奠定了基础.     

酵母中性脂快速检测及积累动态分析

以油红O、苏丹黑B为染料,结合酸或碱热破壁萃取,建立了通过比色快速检测酵母中性脂含量的方法。其中油红O萃取效果较好,比色结果更加准确,苏丹黑B也可以作为一种替代的中性脂含量检测的染料。并用该方法初步研究了两种中性脂肪甘油三酯代谢调控的关键基因磷脂酸磷酸酶(PAH1)和甘油三酯脂酶(triglyceride lipase,TGL)敲除突变体中性脂的变化。结果显示,前者甘油三酯显著降低,但总中性脂肪含量不变,后者甘油三酯及总中性脂肪含量均明显积累;同时,用该方法监测了酵母中性脂含量随生长周期的动态变化,表明指数生长期后有明显的积累。