花生主要变应原Ara h2的克隆及原核表达

目的:在原核载体中克隆、表达花生主要变应原Ara h2,为其重组变应原应用研究奠定基础。方法:合成花生主要变应原Ara h2基因,设计特异性引物行PCR扩增,经Eco RⅠ、HindⅢ双酶切后与做相应酶切的pET-28a载体连接,转化大肠杆菌BL21,提取质粒进行双酶切鉴定及测序分析,使用IPTG诱导融合蛋白表达,使用Ara h2特异性多克隆抗体对表达产物进行免疫印迹鉴定。结果:成功扩增了Ara h2基因,重组质粒双酶切见目的条带,基因测序显示Ara h2在正确开放阅读框中,基因长423bp,编码140个氨基酸,预测的等电点为5.3,分子量约16660.17 Da,基因比对分析显示其与相关报道的核苷酸序列一致性达100%。重组pET-28a-Ara h2/BL21经0.6 mmol/L IPTG诱导表达可见重组融合蛋白在相应分子量大量表达,使用Ara h2多克隆抗体免疫印迹法能检测到目的蛋白。结论:成功克隆、表达了花生主要变应原Ara h2,为其重组变应原应用研究奠定了基础。     

金黄色葡萄球菌LDH多克隆抗体制备及其交叉反应性

目的:在原核载体中表达、纯化金黄色葡萄球菌乳酸脱氢酶,免疫小鼠获得多克隆抗体,使用多克隆抗体分析与其它菌种的交叉反应性。方法:复苏p ET28a-ldh/Bl21重组菌,IPTG诱导重组融合蛋白表达、以抗HIS标签的单克隆抗体进行western-blot鉴定重组蛋白。使用纯化的重组蛋白以及相应的佐剂免疫小鼠,利用ELISA测定血清抗体效价,并使用小鼠抗血清进行免疫印迹法鉴定重组蛋白的反应原性及其与金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎链球菌、粪肠球菌、大肠埃希菌的交叉反应性。结果:SDS-PAGE电泳在39 KDa处可见目的条带,免疫印迹法验证了重组LDH的表达,纯化后获得2.8 mg重组蛋白。纯化蛋白免疫小鼠能诱导产生特异性体液免疫应答,ELISA检测特异性Ig G效价为1:50000,western-blot鉴定显示所制备的多克隆抗血清能分别识别金黄色葡萄球菌重组及天然乳酸脱氢酶,但不识别表皮葡萄球菌、肺炎链球菌、粪肠球菌、大肠埃希菌中天然乳酸脱氢酶。结论:纯化的LDH具有良好的免疫活性,免疫小鼠获得高滴度的多克隆抗体。使用多克隆抗体western-blot显示与其它菌种LDH不存在交叉反应性,为后续使用该重组蛋白进行金黄色葡萄球菌感染的诊断研究奠定基础。     

金黄色葡萄球菌LukF-PV基因的原核表达及血清特异性抗体的检测

目的:在大肠杆菌中表达金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)LukF-PV基因,纯化重组蛋白并以其为抗原检测儿童SA感染者血清特异性IgG抗体,分析不同部位SA感染患者血清LukF-PV抗体水平。方法:将Luk F-PV克隆至pET-28a(+)载体,IPTG诱导重组蛋白表达、His柱纯化重组蛋白后,用间接ELISA检测儿童SA感染者与健康对照者血清特异性IgG抗体水平。结果:成功表达纯化LukF-PV蛋白,儿童SA感染组与健康对照组血清特异性抗体均值分别为(0.309±0.063)、(0.505±0.261),具有统计学意义(P0.05)。不同部位来源标本的感染者中血液组和扁桃体组抗体OD均值分别为(0.634±0.225)、(0.481±0.264)与健康对照组有显著差异(P0.05),其余各组与健康对照组无显著差异(P0.05)。抗体阳性率统计分析中血液组分别与脑脊液组、扁桃体组、咽拭子组、痰液组有统计学意义(P0.05),其余各组间均无显著差异(P0.05)。结论:LukF-PV成功表达纯化,,儿童SA感染组LukF-PV特异性IgG抗体显著高于健康对照组,其中来源于血液和扁桃体部位的SA感染者抗体水平与健康者有显著差异,尤以血液感染者最显著。