体外RNA干扰下调DEPTOR表达对人多发性骨髓瘤细胞增殖和凋亡能力的影响

目的:研究探讨应用RNA干扰技术构建人DEPTOR基因的shRNA慢病毒载体,鉴定在多发性骨髓瘤RPMI-8226细胞上的沉默效果,并评价DEPTOR对人多发性骨髓瘤细胞增殖和凋亡能力的影响.方法:设计4个DEPTOR siRNA序列,化学合成后退火形成双链,克隆到酶切的hU6-MCS-CMV-EGFP(GV115)-shRNA慢病毒载体.重组质粒经PCR测序鉴定后,脂质体介导下转染293T细胞,Western blot检测DEPTOR的表达,筛选出干扰效果最佳的GV115-shRNA.将筛选的GV 115-shRNA与慢病毒包装质粒共转染293T细胞生成病毒,收集病毒上清并浓缩,测定浓度.将病毒颗粒感染多发性骨髓瘤RPMI-8226细胞,应用Real-time PCR方法从mRNA水平及Western blot方法从蛋白水平检测DEPTOR的沉默效果.运用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测骨髓瘤细胞增殖能力的变化;流式细胞仪检测细胞凋亡;用Western blot分析cleaved caspase-3和cleaved PARP的变化.结果:构建的慢病毒载体shRNA的PCR鉴定和测序正确,成功筛选出最有效抑制DEPTOR表达的shRNA2序列,包装病毒后滴度达到1×109TU/ml.慢病毒感染RPMI-8226细胞后可表达EGFP,Real-time PCR和Western blot检测DEPTOR的表达明显下降.下调DEPTOR基因可显著减慢骨髓瘤细胞的生长速度(P＜0.05),肿瘤细胞的凋亡率上升(P＜0.01).DEPTOR shRNA上调cleaved caspase-3、cleaved PARP和Bax表达,下调Bcl-2及PI3K/Akt信号通路的表达(P＜0.01).结论:成功构建了DEPTOR shRNA重组慢病毒载体,其转染多发性骨髓瘤RPMI-8226细胞后显著抑制了DEPTOR的表达.DEPTOR shRNA可以有效地诱导骨髓瘤细胞的凋亡,并抑制肿瘤细胞的增殖.PI3K/Akt信号通路可能参与了其凋亡过程.     

烷化溶血磷脂对U266 细胞作用的实验研究

为研究烷化溶血磷脂(ET—18-OCH3)对骨髓瘤细胞系U266的体外杀伤作用。通过台盼蓝拒染法和克隆形成率来反映ET—18-OCH3对U266细胞的抗增殖效应;通过荧光显微镜、电镜观察细胞形态学变化,琼脂糖凝胶电泳观察DNA降解片段,流式细胞仪作DNA倍体分析来观察ET—18-OCH3诱导U266细胞凋亡的作用;通过RT—PCR检测bcl-2、c—myc mRNA水平,流式细胞仪检测Bcl-2、C—myc蛋白的表达来初步探讨其相关的作用机制。结果显示．U266细胞经ET—18-OCH3处理后细胞生长明显受抑,呈时间和剂量依赖性;荧光显微镜,电镜下观察均可见凋亡形态学改变,7．5μg／ml ET—18-OCH3作用24小时后出现典型的DNA降解片段。流式细胞仪检测凋亡率为17．53％;RT—PCR显示bcl-2、c-myc mRNA表达均随ET—18-OCH3作用时间的增加而减弱,ET—18-OCH3作用24小时后,bcl-2、c—myc mRNA分别减少了86％、72％;流式细胞仪检测Bcl-2蛋白、C-myc蛋白分别减少了原来的17％、60％。研究结果表明,ET—18-OCH3对U266细胞的生长具有明显的抑制作用,并可诱导细胞的凋亡,具有明显的抗肿瘤效应。     

外周血树突状细胞的体外培养

本文用塑料贴壁的外周血单个核细胞(PBMNCs)在含自体血浆、rhGM-CSF、rhIL-4和TNFα的RPMI1640培养基,37℃,5%CO2湿化空气培养树突状细胞(DCs).经10天培养,可获得大量具DCs形态学特征的细胞,其有很强的刺激同种淋巴细胞增殖功能,约30%的细胞表达HLA-DR和CD1a.健康志愿者每1×107PBMNCs可收获细胞约5×105.本文培养方法产率高,培养体系简单,用自体血浆代替小牛血清,培养过程简便,这些均适应临床治疗要求.