东亚飞蝗细胞色素P450基因的克隆及表达分析

本文克隆了东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis(Meyen)细胞色素P450(cytochrome P450)基因全长,表达重组蛋白,并对其可溶性进行了分析。通过提取东亚飞蝗总的RNA,反转录成cDNA,设计特异性引物,PCR克隆东亚飞蝗细胞色素P450基因,将测序正确的目的片段克隆至原核表达载体pET-28a中,在大肠埃希菌Escherichia coli Rosetta中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测重组蛋白表达结果。结果表明:东亚飞蝗细胞色素P450基因开放阅读框全长为1 551 bp,编码516个氨基酸,与GenBank中已登录的东亚飞蝗细胞色素P450基因(HM153426)的同源性为99%,重组质粒pET-28a-P450在E.coli Rosetta中获得高效表达,重组蛋白相对分子质量(Mr)约为53 000,主要以包涵体的形式存在。     

东亚飞蝗主要过敏原精氨酸激酶基因的克隆表达、纯化及免疫原性鉴定

本研究克隆了东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis(Meyen)精氨酸激酶(arginine kinase,AK)基因全长,表达并纯化重组AK蛋白,研究重组蛋白的免疫反应性。东亚飞蝗AK基因开放阅读框全长为1 068 bp,编码355个氨基酸,与GenBank中已登录的东亚飞蝗AK(DQ513322)基因同源性为98%,重组质粒pET-28a-AK在E.coli中获得高效表达,重组蛋白相对分子质量(Mr)约为40 000,主要以可溶性形式表达,经亲和层析获得重组蛋白。通过免疫印迹分析结果表明,重组AK蛋白可被过敏性患者血清识别,免疫原性良好。结果表明我们成功获得东亚飞蝗精氨酸激酶全长基因并表达出重组AK蛋白,重组AK蛋白具有良好的免疫反应性。     

东亚飞蝗雄性生殖系统组织结构观察及三维可视化数字模型

本文研究东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis(Meyen)雄性生殖系统组织解剖结构及三维可视化数字模型的构建。采用石蜡切片技术对东亚飞蝗进行组织切片,脱水、透明、HE染色和拍照;并应用冰冻切片技术将冰冻包埋剂包埋后的飞蝗雄性个体进行连续切片,进行截面图像信息采集,建立数据集;通过Photoshop、Image-Pro Plus(IPP)软件对雄性生殖器官截面图像进行分割、处理、序列化和三维重建。通过试验观察分析东亚飞蝗雄性生殖器官精巢、附腺、输精管、精球囊和射精囊及交配器的组织构造;并成功构建了飞蝗雄性生殖系统的三维结构可视化数字模型。该模型可以任意旋转,能从不同角度观察,该试验为研究和教学提供了理论基础。     

东亚飞蝗脑的形态学观察及三维重建

本文主要研究东亚飞蝗Locusta migratoria manilansis(Meyen)脑部的形态结构及其三维重建模型。采用石蜡包埋切片,在光镜下观察了东亚飞蝗脑部的形态结构,其由前脑、中脑和后脑3部分组成。为了获得整只蝗虫的连续、完整的图像数据集,采用冰冻切片技术将冰冻包埋剂(OCT)包埋的飞蝗成虫做连续切片。然后利用图像处理方法对飞蝗脑部的连续切片进行配准、分割,再用三维重建软件Image-Pro Plus(IPP)对分割后的脑部二维图像序列进行三维重建,构建出的飞蝗脑部三维结构模型可以任意旋转,能从不同角度观察。其结果为蝗虫生理和防蝗治蝗提供科学依据。     

东亚飞蝗主要过敏原的分析、鉴定与纯化

通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis(Meyen)的蛋白质组分并测定其分子量,收集过敏病人血清,采用免疫印迹(Western—blotting)法鉴定其过敏原成分,通过凝胶过滤层析对东亚飞蝗过敏原进行分离纯化。结果表明:东亚飞蝗蛋白粗提液条带大概有30条左右,其中主带大约有10条,相对分子量约为13、15、25、28、40、45、55、70、100、110ku,其中蛋白含量最丰富的约在70ku左右。免疫印迹结果显示,蝗虫过敏条带主要有5条,相对分子量分别约为19、29、38、70、130ku。通过凝胶过滤层析对东亚飞蝗过敏原进行分离纯化,得到了一个高纯度相对分子质量约为70ku东亚飞蝗过敏原,并且发现了一个相对分子质量约为130ku的蝗虫新过敏原。本研究为临床上蝗虫食物变态反应性疾病的诊断和治疗奠定基础。