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【背景】成簇规律间隔的短回文重复序列相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein,CRISPR/Cas9)已被广泛证实是高效、强大的第三代基因编辑工具,在发现功能基因等领域取得了重要进展,但至今尚无利用该方法挖掘猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)宿主基因的报道。【目的】利用CRISPR/Cas9系统在全基因组范围内筛选PEDV复制相关基因,并进行候选基因的初步验证,为培育抗PEDV种猪提供科学参考。【方法】通过CRISPR/Cas9技术构建人肝癌细胞系(Huh-7)全基因组敲除文库,利用PEDV感染Huh-7文库细胞,随后经过高通量测序筛选影响PEDV复制的关键宿主因子,结合基因干扰和检测病毒效价等相关试验对影响PEDV复制的候选基因进行初步验证。【结果】构建了CRISPR/Cas9系统在全基因组范围内筛选PEDV复制相关基因的方法,将富集程度排名靠前的整合素α11(integrin α11,ITGA11)、哺乳动物复制蛋白A2(replication protein A2,RPA2)、驱动蛋白家族成员2A(kinesin family member 2A,KIF2A)、诱导髓系白血病细胞分化蛋白1(induced myeloid leukemia cell differentiation protein 1,MCL1)、多聚ADP核糖化酶1[poly(ADP-ribose)polymerase 1,PARP1]和囊泡单胺转运蛋白(vesicular monoamine transporter,SLC18A1)基因进行了验证;采用siRNA对上述基因分别进行干扰后,结果与对照组相比,干扰ITGA11可显著降低PEDV猪源靶向细胞IPEC-J2中PEDV-NmRNA、蛋白表达水平及子代病毒滴度。【结论】基于CRISPR/Cas9系统的全基因组敲除文库可作为挖掘PEDV复制相关功能基因的有效工具,ITGA11基因可作为一种制备抗PEDV猪种潜在的靶基因。 相似文献
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肠黏膜屏障的完整性与猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）的致病性密切相关。黏蛋白2(Mucin 2,Muc2)作为肠黏膜屏障的重要组成蛋白，在阻止病原体、毒素和异物入侵等方面发挥重要作用。本文旨在探究黏蛋白Muc2对PEDV复制的拮抗作用。通过观察PEDV感染仔猪空肠黏膜屏障情况，利用RNA干扰策略和分子病毒学检测方法在细胞水平上研究分析Muc2表达水平与PEDV复制的关系，并进一步探讨猪源Muc2天然蛋白发挥抗PEDV作用的具体阶段。结果显示：PEDV感染仔猪空肠段进行PAS染色发现，病毒感染后肠绒毛表面黏液层变薄，结构被破坏，杯状细胞明显减少；与对照组相比，干扰Muc2基因能够上调PEDV-N的mRNA及蛋白水平；Muc2蛋白添加后显著抑制PEDV-N蛋白的表达，且病毒mRNA水平显著下降（P<0.05）；在病毒感染前使用50μg/mL Muc2蛋白预处理1 h后，PEDV-N mRNA相对表达量极显著下降（P<0.001），而在病毒吸附、入侵和复制阶段无显著差异（P>0.05），表明Muc2具有降低PEDV... 相似文献
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