针对miR-221基因干扰慢病毒载体的构建及其有效靶序列的筛选与检测

目的：构建携带人miR-221基因的miRNA干扰慢病毒载体并寻找其有效靶序列,为胶质瘤的研究提供一种新的方法。方法：合成含干扰序列的双链DNAoligo直接连入酶切后的RNA干扰载体上。将产物转入细菌感受态细胞,对长出的克隆进行PCR鉴定,阳性克隆即为目的基因RNA干扰慢病毒载体质粒。再将目的基因与目的载体分别进行双酶切,纯化酶切产物后进行定向连接,其产物转入细菌感受态细胞,再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和分析比对,比对正确即为融合蛋白过表达质粒载体,然后将两种质粒共转染入293T细胞,用westernbolt法检测其有效敲减靶序列。结果：重组质粒经测序鉴定证明各转录模板完整、正确插入到相应质粒中,共转染后发现编号为PscSI576的靶点干扰效果最好。结论：本实验成功构建了人miR-221基因的RNA干扰慢病毒载体,并找到了有效的干扰靶序列。     

针对miR-221 基因干扰慢病毒载体的构建及其有效靶序列的 筛选与检测

目的:构建携带人miR-221基因的miRNA干扰慢病毒载体并寻找其有效靶序列,为胶质瘤的研究提供一种新的方法。方法:合成含干扰序列的双链DNAoligo直接连入酶切后的RNA干扰载体上。将产物转入细菌感受态细胞,对长出的克隆进行PCR鉴定,阳性克隆即为目的基因RNA干扰慢病毒载体质粒。再将目的基因与目的载体分别进行双酶切,纯化酶切产物后进行定向连接,其产物转入细菌感受态细胞,再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和分析比对,比对正确即为融合蛋白过表达质粒载体,然后将两种质粒共转染入293T细胞,用westernbolt法检测其有效敲减靶序列。结果:重组质粒经测序鉴定证明各转录模板完整、正确插入到相应质粒中,共转染后发现编号为PscSI576的靶点干扰效果最好。结论:本实验成功构建了人miR-221基因的RNA干扰慢病毒载体,并找到了有效的干扰靶序列。