突变型乙肝病毒核心抗原DNA疫苗的体外表达

目的:构建突变型核心抗原核酸疫苗,观察该核酸疫苗在体外蛋白的表达.方法:采用基因工程定点突变技术,构建5种突变型核酸疫苗,分别去除乙肝病毒核心抗原N端的第1、2位氨基酸,命名为M12,去除3、4位氨基酸命名为M34以及去除5、6位的氨基酸命名为M56,用上述构建的核酸疫苗与野生型HBc核酸疫苗(pJW4303/Hc)及空载体质粒pJW4303分别用脂质体转染293T细胞,应用蛋白印迹法检测核心蛋白的表达.结果:经过pstl和BgI双酶切和测序鉴定结果突变型核心抗原核酸疫苗构建成功.在去除2个氨基酸的核酸疫苗结果中显示:野生型pJW4303/HBe、M12、及M56体外转染293T细胞后,在细胞上清和裂解中能很好的表达,而M34上清未见表达,仅裂解中可见极少量疑似表达条带;在原有基础上分别去除第3位和第4住氨基酸,命名为M3和M4,结果显示M3上清未见表达,裂解液中可见少量表达,而M4在上清和裂解中均可见明显的表达.结论:去除核心抗原N端第3位的氨基酸(M3)可以明显影响核心抗原的表达,HBcAg氨基端第3位氨基酸对蛋白的表达可能起到重要的作用.     

密码子优化对DNA疫苗免疫原性的影响

DNA疫苗作为疫苗研制工业中的新成果已经得到了越来越多得关注。为了提高其免疫原性,发挥它最大的保护作用,人们进行了各种尝试。近几年来的研究表明,通过密码子优化的方式可以提高DNA疫苗的免疫原性,增强其免疫保护作用。本文即针对该问题做了一些总结。     

乙型肝炎病毒核心抗原及Flt3配体双表达核酸疫苗的小鼠免疫应答研究

目的 构建乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)和Flt3配体(FL)胞外段双表达核酸疫苗,并观察其免疫原性。方法 分别将HBcAg、FL基因克隆入pJW4303载体,获得双表达核酸疫苗,体外转染293T细胞检测目的基因的表达。分组免疫BABL／c小鼠,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠血清抗-HBc IgG效价,酶联免疫斑点试验(ELISPOT)检测HBcAg特异性Th1／Th2型细胞因子的分泌水平。结果 所构建疫苗在体外均能表达HBcAg和FL,当基因位于内部核糖体切入位点(IRES)元件上游时表达水平明显较优。pJW4303／C／FL免疫组产生的抗-HBc IgG效价和Th1／Th2型细胞因子的分泌水平均显著优于pJW4303／C和pJW4303／FL／C组。结论 成功构建双表达核酸疫苗,基因位于上游时表达水平高于下游。FL基因的引入明显增强了HBcAg核酸疫苗的免疫原性。     

不明原因发热的临床综合诊断

不明原因发热是临床常见疑难疾病,其定义随着疾病种类的不断变化及诊断流程的进步而逐步完善。不明原因发热(feverof unknown origin,FUO)病因包括感染性疾病、风湿免疫性疾病及肿瘤性疾病三大类,三大病因各自具有不同临床特征。详细病史采集、全面体格检查及常规实验室检查对诊断FUO至关重要,必要时应及时进行相关影像学及病理学检查,疾病的最终诊断应综合分析病史及实验室检查。     

N-糖基化移位对乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白核酸疫苗的表达及免疫原性的影响

目的：研究N-糖基化移位对乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白核酸疫苗体外蛋白表达及小鼠体内体液免疫及细胞免疫应答的影响。方法：通过基因工程中定点突变技术,将乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白（MHBs）中第4位氨基酸上连接的糖链去除,或将糖链依次移位至第5、6或7位氨基酸,来构建N-糖基化去除及移位的核酸疫苗,分别命名为Adr—dN4、Adr-N4—5、Adr—N4．6、Adr—N4．7。用上述核酸疫苗与野生型MHBs核酸疫苗（pSW3891／MHBs／Adr,简称Adr）及空载体质粒pSW3891分别用脂质体瞬时转染293T细胞,应用蛋白印迹法检测MHBs的表达。采用肌肉注射法,以各组疫苗分别对BALB／c小鼠于第0、2、4和6周进行免疫．用ELISA法检测小鼠血清中抗．HBs抗体、ELISPOT法检测小鼠表面抗原多肽特异性分泌IFN-T的脾细胞数量。结果：蛋白印迹法结果显示Adr、Adr-dN4、Adr—N4．5、Adr—N4—6、Adr-N4—7体外转染293T细胞后,均可以在293T细胞内表达,且Adr、Adr-N4—5、Adr-N4—7可将表达产物分泌到细胞外。ELISA及EISPOT结果表明：Adr免疫组小鼠抗-HBs终点滴度及表面抗原特异性分泌IFN-γ的脾细胞数量,均略高于其他免疫组小鼠,但与Adr—N4—5、Adr．N4—7相比无统计学差异（P〉0．05）,与Adr-dN4和Adr—N4—6组相比有显著的统计学差异（P〈0．05）。结论：在第5或7位氨基酸附加N-连接糖链,能修补或替代Asn4连接糖链引导MHBs分泌的功能。HBs表达蛋白分泌到细胞外对诱导机体产生特异性细胞和体液免疫是至关重要的。     

密码子优化对DNA疫苗免疫原性的影响

DNA疫苗作为疫苗研制工业中的新成果已经得到了越来越多得关注。为了提高其免疫原性,发挥它最大的保护作用,人们进行了各种尝试。近几年来的研究表明,通过密码子优化的方式可以提高DNA疫苗的免疫原性,增强其免疫保护作用。本文即针对该问题做了一些总结。     

随机扩增多态性技术联合荧光定量高敏检测三种疱疹病毒方法的建立

目的:建立一种随机扩增多态性技术(RAPD)联合荧光定量聚合酶链式反应(q PCR)高敏定量检测单纯疱疹病毒(HSV)、人类巨细胞病毒(HCMV)、水痘带状疱疹病毒(VZV)的新方法。方法:根据文献筛选出数十条随机引物,分别对三种疱疹病毒进行随机扩增,产物经2%琼脂糖凝胶电泳,选取稳定清晰条带进行分离、纯化及克隆测序,应用blast-nr比对genebank现有病毒序列,选取高于99%匹配度的基因序列作为目的片段,并在其内部用primer3.0设计特异性内引物。经过引物筛选及条件优化后建立RAPD联合q PCR检测新方法,分别检测三种疱疹病毒。结果:经过筛选,确定了HSV、HCMV、VZV扩增灵敏性及特异性最好一组引物,建立的RAPD-q PCR可分别检测出1:10~6 HSV、1:10~5 HCMV和1:10~5 VZVDNA,而单一q PCR仅能检测1:10~3 HSV、1:10~2HCMV和1:103 VZVDNA。RAPD-q PCR相比于单一q PCR灵敏性提高100-1000倍,RAPD-q PCR扩增大于1:10~5病毒DNA得到的CT值均小于22.96±0.81,与10~2 copies/μL的标准线相距远,易于区分阴性和阳性。此外,用乙型肝炎病毒及疱疹病毒互为对照未见非特异扩增,特异性好。结论:随机扩增多态性技术联合荧光定量是一种检测三种病毒高度灵敏及特异的检测方法。     

DNA疫苗预敏蛋白疫苗增强策略对乙型肝炎病毒表面抗原蛋白免疫应答的影响

目的:观察核酸疫苗预敏,乙型肝炎病毒HBsAg蛋白疫苗增强的免疫对Balb/c小鼠免疫应答的影响.方法:以TransfectionTM脂质体将乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白(MHBs)核酸疫苗pSW3891/MHBs/adr(简称为adr),及空载体pSW3891(简称vector)体外转染293T细胞.免疫印迹法(Western blot)检测adr,vector的体外表达;动物体内研究选用Balb/c小鼠共18只,每组6只,编号后随机分为3组,即空载体质粒组(vector+vector组)、adr核酸疫苗+HBsAg蛋白疫苗(adr+protein组)、HBsAg蛋白疫苗+HBsAg蛋白疫苗(Protein+Protein组);于第0周肌肉注射法分别以vector、adr及HBsAg蛋白疫苗免疫小鼠,于第4周肌内注射法分剐以vector、HBsAg蛋白疫苗、及HBsAg蛋白疫苗免疫小鼠.采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠血清HBsAg特异性抗体、酶联免疫斑点(ELISPOT)法检测小鼠脾细胞HBsAg多肽特异性IFN-γ分泌细胞.结果:adr体外转染293T细胞后,能够表达乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白(MHBs);体内研究结果显示:除vector+vector组外,adr+protein组、Protein+Protein组小鼠均能检出血清抗-HBs,Protein+Protein组抗-HBs终点滴度比adr+protein组高,但无统计学意义;三组中vector+vector组没有检测到特异性INF-γ分泌的脾细胞,而adr+protein组、Protein+Protein组小鼠均能检出,且adr+protein组特异性细胞数量显著高于protein+protein组(P＜0.001),具有统计学意义.结论:乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白(MHBs)核酸疫苗预敏.能明显增强Balb/c小鼠对乙型肝炎HBsAg蛋白疫苗细胞免疫应答水平.     

外分泌型的乙型肝炎病毒核心抗原核酸疫苗的构建与体外表达

目的:构建含有组织型纤溶酶原激活剂(tPA)信号肽的乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)核酸疫苗。方法将HBcAg基因用PCR方法扩增并分别引入相应的限制性内切酶酶切位点,然后克隆入pJW4303载体中获得相应的核酸疫苗,经筛选鉴定后,用上述核酸疫苗与野生型HBcAg核酸疫苗及空载体质粒pJW4303分别用脂质体瞬时转染293T细胞,应用蛋白印迹法检测核心抗原的表达。结果成功构建以pJW4303为载体的含tPA信号肽的HBcAg核酸疫苗,体外表达证实含tPA信号肽的HBcAg在293T细胞胞内和胞外均能表达,含tPA信号肽的HBcAg核酸疫苗的核心抗原表达水平较高。结论以pJW4303为载体的含tPA信号肽的HBcAg核酸疫苗能够将细胞内的HBcAg分泌到细胞外,为进一步研究其免疫原性打下了基础。     

一种随机引物联合多特异性DNA片段检测结核分支杆菌的新方法

目的:针对目前结核性疾病实验室诊断的局限性,探索一种更为敏感和特异的结核分枝杆菌DNA检测新方法。方法:选取10株江苏地区流行的结核分支杆菌(MTB)菌株,选取临床其他常见菌株及分枝杆菌菌株作为对照组,分别提取DNA作为随机引物的模板。参考国内、外文献设计12条随机引物,并分别对MTB及对照菌株进行单个引物随机扩增,2%的琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行分离并切胶纯化,通过TA克隆将纯化片段连接到质粒pEASYTM-T5 Zero并进行测序,通过BLAST-nr比对验证是否为MTB DNA片段。按照所确定的MTB片段序列,在其内部设计、合成一对特异性引物。用此特异性引物扩增对应的随机引物扩增产物,获得MTB特异性条带图谱。并将该方法检测的敏感性和特异性与临床上常用的real-time PCR进行比较。结果:经BLAST-nr比对,随机引物IS986F,S535及IS986R扩增的条带与MTB DNA有高度同源性(均为99%)。随机引物IS986F、S535和IS986R分别联合其特异性引物可以检测稀释105倍、105倍和103倍的MTB DNA,其特异性分别为100%、90%和80%。常规real-time PCR可检测出稀释104倍的MTB DNA。结论:随机引物IS986F联合其特异性引物检测结核分枝杆菌的灵敏度和特异性优于S535、IS986R两组,特异性为100%,且灵敏度优于常规real-time PCR法。