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应用PCR技术,从产气荚膜梭菌菌株NCTC64609中,扩增出A型产气荚膜梭菌α毒素基因C端片段(cpa408),并将其克隆至pMDl8-T载体中.经转化,α互补蓝白菌落选择培养,提取质粒,进行PCR和Eco RⅠ、PstⅠ双酶切鉴定,筛选出阳性重组克隆.经核苷酸序列分析证实,cpa408基因阅读开放框架由372个核苷酸组成,编码124个氨基酸.经计算机分析,cpa408基因序列与国外文献报道的A型产气荚膜梭菌α毒素基因C端片段同源性达99%以上,表明所克隆的基因即为α毒素基因C端片段. 相似文献
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A型产气荚膜梭菌α毒素全基因的分子克隆与核苷酸序列分析 总被引:1,自引:1,他引:0
应用PCR技术,从A型产气荚膜梭菌菌株NCTC64609中扩增出A型产气荚膜梭菌α毒素全基因(cpa 1229基因)并将其克隆至pMDl8-T载体中。经转化、IPTG/X—gal选择培养,提取质粒,PCR和EcoRI/Pstl双酶切鉴定,筛选阳性重组克隆。经核苷酸序列分析证实,cpa1229基因阅读开放框架由1194bp组成。经GenBank检索对照分析,cap1229基因序列与国外献报道同源性达98.3%,表明本实验所克隆的cpa1229基因即为A型产气荚膜梭菌α毒素基因。 相似文献
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将特异肉毒抗毒素基因克隆入载体pPIC9k,G418抗性加压筛选阳性整合克隆,在毕赤酵母细胞GS115中进行分泌表达。获得了稳定分泌表达ScFv的工程菌,SDS-PAGE分析可见,目的蛋白分子量约为26kD,通过放大体积来探索重组抗毒素的诱导表达条件及纯化工艺,结果发现,1%甲醇诱导后72~84h,目的蛋白的表达达到高峰,占酵母培养上清中总蛋白的15%以上,经两步层析纯化,目的蛋白纯度可达95%。竞争活性测定结果表明,重组抗毒素在体外具有良好的活性,可竞争肉毒抗毒素马血清与毒素的特异结合。 相似文献
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重组A型产气荚膜梭菌α毒素保护性抗原的制备及初步免疫保护作用研究 总被引:4,自引:0,他引:4
诱导表达重组工程菌Pbv/cpa408后,将表达菌体超声破碎,上清经80%饱和硫酸铵一次沉淀,经透析,上凝胶过滤层析柱进行分离纯化,薄层凝胶扫描结果显示,纯化的蛋白纯度达95%以上;用纯化蛋白免疫昆明小鼠,以1.0MLD100腹腔进行攻击,被免疫小鼠获得了100%的保护。 相似文献
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破伤风毒素保护性抗原在毕氏酵母中的分泌表达 总被引:4,自引:0,他引:4
采用PCR方法.从C.Tetani 64008菌株中扩增大小为1353bp的破伤风毒素与靶细胞起结合作用的重链C端基因(Tetc),直接连接pGEM-T栽体进行测序,并以pPIC9K为表达栽体构建重组表达质粒,经线形化的重组质粒电转化毕氏酵母细胞GS1l5和KM71.甲醇诱导获得了分泌表达,表达产物存在于培养上清中,占分泌蛋白的10%,通过免疫印迹可以检测到重组表达产物,活性测定表明,重组蛋白具特异结合活性,本研究通过实现破伤风毒素保护性抗原在酵母系统中的分泌表达、研究其影响因素,为其它细菌毒素蛋白高效可溶性表达,及进一步抗原片段介导保护性免疫研究及抗毒素制备奠定了基础。 相似文献
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在成功克隆A型产气荚膜梭菌α毒素C端基因(cpa408基因)后,发现基因N端ATG后密码子在大肠杆菌中的使用频率普遍偏低,在不改变氨基酸的前提下,对N端基因进行修饰,构建重组表达质粒pBV220cpa408,导入大肠杆菌DH5α中,经温度诱导,cpa408基因获得了高效表达,表达量达菌体总蛋白的4375%,表达产物以可溶形式存在。经Westernblot分析,表达产物能被标准抗α毒素血清识别。 相似文献
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A型肉毒毒素表位多肽免疫和人源噬茵体单链抗体文库的构建 总被引:1,自引:0,他引:1
采用表位合成多肽免疫获得编码人源抗体的基因材料,抗体轻重链可变区基因通过剪接重叠延伸(SOE)技术进行组装后,亚克隆入噬菌体粒中构建免疫库。以重组制备的A型肉毒毒素保护性抗原为配体筛选结合子,ELISA鉴定,获得具有较高抗原结合力的噬菌体克隆,进行基因测序和家族定位分析。结果显示,表位合成多肽免疫,成功构建了库容大于10^8的重组抗体库。体外3轮免疫淘筛,筛选到人源A型肉毒抗毒素克隆,基因结构分析表明,其中ScFvB17全长750bp,可编码250个氨基酸残基:VH属于VH4家族,369bp,编码123个氨基酸残基;Vκ属于κ链Ⅱ家族,336bp,编码112个氨基酸残基。基因的同源分析表明,这是一株特异的单链抗体新基因。 相似文献
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将特异肉毒抗毒素基因克隆入载体pPIC9k,G418抗性加压筛选阳性整合克隆,在毕赤酵母细胞GS115中进行分泌表达。获得了稳定分泌表达ScFv的工程菌,SDS—PAGE分析可见,目的蛋白分子量约为26kD,通过放大体积来探索重组抗毒素的诱导表达条件及纯化工艺,结果发现,1%甲醇诱导后72~84h,目的蛋白的表达达到高峰,占酵母培养上清中总蛋白的15%以上,经两步层析纯化,目的蛋白纯度可达95%。竞争活性测定结果表明,重组抗毒素在体外具有良好的活性,可竞争肉毒抗毒素马血清与毒素的特异结合。 相似文献
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