AUT凝胶电泳在牛胰核糖核酸酶折叠研究中的应用

目的:牛胰核糖核酸酶是一种用于蛋白折叠研究的经典模式蛋白,在折叠研究过程中主要使用高效液相色谱用于分离检测不同阶段的蛋白折叠中间体。高效液相色谱具有自动化、分离效果好、样品可回收等优点,同时也存在检测通量较低、仪器设备较为昂贵等不足。AUT凝胶电泳简便、快捷、检测通量较高,本文尝试将其应用于牛胰核糖核酸酶的折叠研究。方法:使用AUT凝胶电泳、酶活性检测、质谱对牛胰核糖核酸酶还原变性过程及产生的折叠中间体进行检测;通过高效液相色谱和质谱对折叠中间单体进行分离检测,并分别进行AUT凝胶电泳检测以解析各折叠中间单体在电泳中的条带位置;通过AUT凝胶电泳和酶切后质谱鉴定各折叠中间单体的二硫键配对方式。结果:AUT凝胶电泳可以有效区分不同条件下的牛胰核糖核酸酶还原变性过程,检测结果与酶活性、质谱结果相符,并可以很好地区分牛胰核糖核酸酶还原变性过程折叠中间体。高效液相色谱将牛胰核糖核酸酶还原变性过程折叠中间体分离为13个色谱峰,并与AUT凝胶电泳中的11个条带位置进行匹配。确认牛胰核糖核酸酶还原变性过程折叠中间单体的二硫键配对方式,并与AUT凝胶电泳条带进行匹配,Cys58-Cys110和Cys26-Cys84构象熵减作用强于Cys40-Cys95和Cys65-Cys72。结论:AUT凝胶电泳适用于检测牛胰核糖核酸酶折叠中间体,可以与高效液相色谱、质谱等检测技术相互补充,共同应用于牛胰核糖核酸酶的折叠研究。     

精氨酸对牛胰核糖核酸酶氧化复性的时相性抑制作用

精氨酸常在重组蛋白的体外复性中,作为一种小分子添加剂用于抑制蛋白聚集。精氨酸对蛋白复性折叠过程本身的影响尚不清楚。首次以不易聚集的牛胰核糖核酸酶为研究对象,通过飞行质谱检测氧化复性中间体的变化,通过酶学活性检测蛋白活性的恢复过程,观察了精氨酸对氧化复性的直接影响。发现不同浓度精氨酸对牛胰核糖核酸酶的氧化复性有直接的抑制作用。特别在0.5 mol/L浓度时,精氨酸对牛胰核糖核酸酶氧化复性的抑制作用具有独特的时相依赖性:早期复性可持续至4 h,其活性恢复达30%后,晚期复性基本终止。这种抑制特征与脲的抑制作用有明显的不同,精氨酸没有完全抑制关键结构中间体的形成。结果说明,牛胰核糖核酸酶的氧化复性,除经关键结构中间体的主要通路外,还可能存在一个潜在复性通路,它是其氧化复性后期的关键限速通路。该复性通路可以被0.5 mol/L精氨酸完全阻断。