新生隐球菌漆酶的原核表达

目的构建含His-tag的新生隐球菌漆酶的原核表达载体并表达鉴定。方法利用PCR技术扩增LAC1基因的编码序列,将其正确插入pET-28a(+)载体中得到重组质粒,转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞后进行PCR鉴定及基因测序。将正确重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,通过不同条件进行诱导表达,用SDS-PAGE电泳及MALDITOF质谱检测并鉴定目的蛋白质。通过尿素对包涵体蛋白进行变性,并对变性后的蛋白进行SDS-PAGE电泳及MALDITOF质谱检测。结果成功构建含His-tag的新生隐球菌漆酶的原核表达载体,PCR鉴定呈阳性且基因测序结果与目的序列一致,SDS-PAGE显示在大肠杆菌BL21中成功诱导表达出相对分子质量(Mr)约为68 000的目的蛋白,经MALDITOF质谱鉴定目的蛋白在此表达系统中不可溶,可能以包涵体形式存在。结论成功构建含His-tag的新生隐球菌漆酶的原核表达载体,为进一步纯化并解析新生隐球菌漆酶的晶体结构奠定了基础。